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响应面优化混菌发酵蜂王幼虫制备抗氧化肽及其结构鉴定
蜂王幼虫又称蜂子、蜂王胎或蜂皇胎，由蜜蜂的受精卵孵化约 约 3 3 日龄而成的幼虫体，始终以工蜂分泌的蜂王浆为食物，是蜂王浆生产过程中的必然产品。我国蜂王浆年产量约3000t，产量和出口量占全球总量的 90%以上，一般每生产1kg 蜂王浆，可收获蜂王幼虫 0.2～0.3kg[1]。蜂王幼虫营养成分丰富，是一类高蛋白且氨基酸组成全面、维生素含量丰富的可食用昆虫，然而其蛋白制品通常只是进行简易的加工，技术含量和附加值低，近年来蜂王幼虫肽产品开发受到关注。主要研究侧重于不同的商业酶酶解蜂王幼虫的工艺优化以及活性研究，但得到的多肽抗氧化活性并不强，对多肽的结构表征也少[2]。
已有研究发现，从蚕蛹、蜂蛹、黄粉虫等昆虫蛋白中制备得到的活性肽均表现出较好的抗氧化活性，生产应用前景广阔[3- - 5] 。蜂王幼虫和蜂蛹相似，都是蜜蜂发育过程中的幼虫体，富含高度同源的蛋白质，值得开发利用，而且我国蜂王幼虫资源充足，与畜牧行业生产动物性蛋白相比碳排放量低，可实现绿色生产，有工业化生产潜力，然而大多数的蜂王幼虫蛋白资源仍未得到有效利用。相比酶解法，微生物发酵法所产蛋白酶系丰富，能将微生物产酶和酶解蛋白工艺同时进行，酶解效率更高，省去酶的分离和提纯的步骤，降低了生
产成本[6]；微生物发酵法在蜂王幼虫活性肽产品开发和应用上研究较少，这也为工业化生产蜂王幼虫活性肽提供一条可行的途径。枯草芽孢杆菌和黑曲霉都是蛋白酶分泌能力强的菌株[7]，根据它们的产酶特点复配使用，理论上会使多肽不仅得率高而且风味好。蛋白酶可以水解蛋白质产生小分子的活性肽和氨基酸[8]，蛋白酶活力和多肽的产率成正比，要提高多肽的得率就要调控发酵条件提高微生物产蛋白酶的活力。本文利用枯草芽孢杆菌和黑曲霉复配发酵蜂王幼虫冻干粉制备抗氧化肽，重点研究不同发酵条件对多肽得率和发酵体系中蛋白酶活力的影响，并对目标抗氧化肽进行分离纯化，测定其体外抗氧化活性并表征其结构，期望为蜂王幼虫的生物活性研究、开发高营养、高附加值的产品提供新的思路。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 主要实验材料 蜂王幼虫冻干粉，湖北某蜂业公司；枯草芽孢杆菌 M2022782,本实验室从蜂 粮中分离鉴定，保藏于中国典型培养物保藏中心；黑曲霉 91006 ，中国典型培养物保藏中心；其余试剂均为国产分析纯。
1.1.2 仪器与设备 YXQ- - LS- -S 30S 立式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司医
疗设备厂； HZQ- -0 160 全温振荡培养箱，太仓市实验设备厂；O MultiskanGO 国 全波长酶标仪，美国 r ThermoFisher 公司；AllegraX- -R 15R 低 温 高 速 离 心 机 ， 美 国 贝 克 曼 公 司 ；BONA- - GM- -8 18 有机膜分离试验机，济南博纳生物技术有限公司；0 A300 全自动氨基酸分析仪，德国曼默博尔公司；4 AL204 真空冷冻干燥 机，梅特勒- - 托利多仪器( ( 上海) ) 有限公司；0 Ultimate3000 液相色谱仪、e QExactive 质谱仪，美国c ThermoScientific 公司。
1.2 实验方法 1.2.1 种子液的制备[7] 挑取 3 3 ～5 5 环活化后的菌种接于已灭菌的装有 L 100mL 液体种子培养基的 L 250mL 锥形瓶中，放入恒温振荡摇床中进行扩大培养一段时间，即得到种子液。
1.2.2 制备工艺 蜂王幼虫粗肽样品制备工艺如下：
蜂王幼虫冻干粉→加水混合(发酵总量 50mL/250mL 锥形瓶)→高温灭菌(105℃，20min)→接种→发酵→沸水浴(100℃，15min)→冷却→离心(4000r/min，15min)→取上清液→蜂王幼虫粗肽样品 1.2.3 蜂王幼虫多肽得率的测定 参考徐萍 [9] 的方法测定蜂王幼虫多肽得率，以肽的质量浓标 度为横坐标 X(mg/mL) ，D OD 标 值为纵坐标 Y Y ，制作标准曲线
y=0.0637x- - 0.0018(R2=0.9987) 。
取 样品的测定：取 L 2mL 入 发酵上清液，加入 1mL10% 的三氯乙酸(trichloroaceticacid ， TCA) ，混匀后静置 30min ，沉淀大分子蛋白，n 4000r/min 离心 15min ，取上清液 1.5mL ，并加入L 1mL 双缩 脲试剂 [V( 样液 )∶V( 双缩脲试剂 )=3∶2] ，混匀后室温静置 30min ，测定 m 540nm 处的吸光值，代入标准曲线计算上清液多肽浓度。根据公式(1)计算多肽得率：
多肽得率 (1) 式中：c c ，发酵液中多肽质量浓度， g/mL ；V V ，发酵粗肽液体积， mL ； X1 ，蜂王幼虫蛋白质的质量分数，% % ；m m ，蜂王幼虫原料质量，g g 。
1.2.4 蛋白酶活力的测定 参照 GB/T23527 —2 2022 《蛋白酶制剂》中的福林法进行测定。根据不同L-酪氨酸浓度对应波长680nm处的吸光值绘制标准曲线 y=0.0071x-0.0012(R2=0.9997)。
1.2.5 发酵工艺的优化 在发酵总量 50mL 、料水比 5% 、摇床转速 180r/min、 、 pH 为 6.5 、度 发酵温度 30℃ 、初始枯草芽孢杆菌 ∶ 黑曲霉复配体积比=2∶1 、接种量 5%( 体积分数) ) 、发酵时间 h 60h 等基础条件下，考察复配体积比 (1∶1 、 1∶2 、 2∶1 、 3∶1 、 1∶3) 、接种量(3% 、 5% 、 7% 、 9% 、 11%) 和发酵时间 (24 、 36 、 48 、 60 、 72h)
对发酵液多肽得率和蛋白酶活力的影响。在单因素试验的基础上，采用响应面分析法中 Box-Benhnken 试验设计优化发酵工艺。
1.2.6 氨基酸组成的测定 测定参照 GB5009.124 — 2022 《食品中氨基酸的测定》。
1.2.7 超滤分离 择 在室温条件下，选择 10 、5 5 、3 3 、a 1kDa 的卷式超滤膜将发酵液进行逐级分离，分别得到 5 5 个分离级分，分别是分子质量a 10kDa 的组分 F5， ，5 5 ～a 10kDa 的组分 F4， ，3 3 ～a 5kDa 的组分 F3 ，1 1 ～a 3kDa 组分 F2 ，a 1kDa 组分 F1 。滤液流速为 0.5～8L/h，膜元件压力 0～0.8MPa。将收集到的各个组分浓缩、真空冷冻干燥得到各组分的冻干粉，-20℃保存，测定其抗氧化活性。
1.2.8 体外抗氧化活性测定 1.2.8.1DPPH 自由基清除率的测定 将经过超滤处理的不同组分的粗多肽冻干粉依次配成 0.5、 、1 1 、1.5 、2 2 、L 2.5mg/mL 的多肽液。参考涂宗财等[10]的方法，分别测定50μL 各浓度待测粗肽液与 150μL的 0.2mmol/LDPPH反应后吸光值 A1。以 50μL 去离子水与 150μLDPPH 溶液混合作为空白对照组 A2，以 50μL 粗肽样品与 150μL95%乙醇混合作为本底对照组A0。按公式(2)计算DPPH自由基清除率：
DPPH 自由基清除率 (2)
计算半抑制浓度 (halfmaxima linhibitoryconcentration ，IC50) ，0 IC50 越小表示 H DPPH 自由基清除力越强。
1.2.8.2ABTS 阳离子自由基清除率的测定 称取经过超滤处理的不同组分蜂王幼虫粗多肽冻干粉，分别配成 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL 多肽液，参考白海娜等[11]的方法，分别测定 50μL 各浓度待测粗多肽液与100μLABTS 阳离子工作液反应后的吸光值 A1，以 50μL 去离子水与100μLABTS阳离子工作液混合作为空白对照组A2，以 50μL 粗肽样品与 100μL 去离子水作为本底对照组 A0，按公式(3)计算 ABTS 阳离子自由基清除率：
ABTS 阳离子自由基清除率 (3) 1.2.8.3 还原力的测定 考 参考 D LASSOUED 等 [12] 的氰化钾氧化法，向试管中加入L 1mL2mg/mL 粗多肽液并依次加入各反应液后，静置 10min ，以蒸馏水代替样品作为空白，m 700nm 测定吸光值，吸光值越大，说明样品还原力越强。
1.2.9 蜂王幼虫低聚肽序列 LC-MS/MS 鉴定[13] 用 抗氧化活性最好的超滤组分多肽序列采用 LC- -S MS/MS 进行鉴定。色谱条件：流动相：流动相 A：0.1%甲酸，流动相 B：0.1%甲酸、80%乙腈(acetonitrile，ACN)，流速 300nL/min；洗脱时间 0～5min，5%B；5～45min，5%～50%B；45～50min，
50%～90%B；50～55min，90%B；55～65min，90%～5%B。质谱 条 件 ：
分 离 后 的 肽 段 直 接 进 入 质 谱 仪ThermoScientificQExactive 进行在线检测，参数如下：(1)一 级 质 谱 参 数 ：
分 辨 率 ：
70000 ； 自 动 增 益 控 制(autogaincontrol ， AGC)target ：
3e6 ； 最 大 驻 留 时 间(maximumIT)：40ms；扫描范围：100～2000m/z；(2)二级质谱参数：分辨率：17500；AGCtarget：1e5；最大 IT：60ms；TopN：20；NCE/steppedNCE：27。数据库检索软件为 Mascot。
1.2.10 实验数据处理 少 所有实验进行至少 3 3 次重复，实验结果以平均值 ± 标准差(mean±SD) 表示，利用 0 IBMSPSSStatistics20.0 对实验结果进行显著性分析，5 P0.05 表示各组数据之间的差异具有统计学意义。图表采用 GraphPadPrism8 绘制及 DesignExpert10进行响应面优化。
2 结果与分析 2.1 单因素结果分析 2.1.1 复配比对混菌发酵蜂王幼虫冻干粉的影响 枯草芽孢杆菌和黑曲霉所产蛋白酶的性质差异较大，前者主要为内肽酶，而且蛋白酶活力高，能够增加蜂王幼虫多肽的产率，但发酵产物臭味重，很难除去；后者则为端肽酶，可以改善蜂王幼虫多肽的风味。由图 1 可知，当枯草芽孢杆菌的接种量≥黑曲霉时，多肽得率和酶活力较高，在接种比为
2∶1 时，达到最大值。这一结果与采用用枯草芽孢杆菌和黑曲霉混合发酵绿豆蛋白粉时结果吻合，同样是枯草芽孢杆菌比例高时多肽浓度更高[14]。这可能是因为枯草芽孢杆菌在发酵初期利用营养物质及生长繁殖能力强于黑曲霉，会成为主要优势菌，增加多肽的产率。选择枯草芽孢杆菌与黑曲霉的接种比例为 1∶1、2∶1 以及 3∶1 作为响应面试验的 3 个水平。
图 1 复配比对酶活力和多肽得率的影响 Fig.1EffectofBacillussubtilistoAspergillusnigerratioonenzymeactivityandpeptideyield 注：不同小写字母表示差异显著(P0.05)(下同) 2.1.2 接种量对混菌发酵蜂王幼虫冻干粉的影响 适宜的接种量可以将微生物的延滞期变短，能更快利用底物进行发酵 。如图 2 所示，在接种量为 3%～7%时，发酵液的多肽得率和蛋白酶活力呈现上升的趋势，达到 7%后，随着接种量的增加，其多肽得率和酶活力不再增加。这一变化趋势与枯 草 芽 孢 杆 菌 发 酵 燕 麦 制 备 血 管 紧 张 素 转 换 酶(angiotensinconvertingenzyme，ACE)肽接种量与多肽得率变化结果相似[15]。当接种量浓度太低时，底物中的蛋白质无法被枯草芽孢杆菌和黑曲霉完全利用，只有部分得到水解；接种量超过一定浓度时会使微生物生长繁殖过快，得到的蜂王幼虫多肽可能会被菌体优先利用，此外培养基黏度增大，
溶解氧不足，微生物生长受到抑制，导致酶活性和多肽得率不高。根据接种量对发酵产物的影响，响应面试验中接种浓度选定为 5%～9%。
2.1.3 发酵时间对混菌发酵蜂王幼虫冻干粉的影响 合理把控发酵时间是在充分发酵物料的基础上，避免营养物质浪费、保证发酵产物质量的关键因素。如图 3 所示，发酵时间在 24～60h，枯草芽孢杆菌和黑曲霉快速繁殖，产生大量的蛋白酶，因此多肽得率和发酵体系蛋白酶活力都呈现上升的趋势，在 60h 达到最大。随着时间的延长，微生物从稳定期进入衰亡期，蛋白酶产量和活力降低，培养基中的营养物质不断被利用，而菌种的生化反应过程并未终止，可能积累其他影响发酵液质量的有害代谢产物，微生物生长受到抑制[16]。还有可能随着时间的增加，产生的多肽类会被进一步水解成氨基酸，多肽得率有所下降[17]。因此选择发酵时间为 48～72h。
图 2 接种量对酶活力和多肽得率的影响 Fig.2Effectofinoculationamountonenzymeactivityandpeptideyield 图 3 发酵时间对酶活力和多肽得率的影响 Fig.3Effectoffermentationtimeonenzymeactivityandpeptideyield 2.2 响应面试验结果与分析
2.2.1 响应面设计方案与结果 件 在单因素试验的基础上，采用软件 0 DesignExpert10 立 建立 3 3因素 3 3 水平的实验设计，以多肽得率 (Y1) 和酶活力 (Y2) 为考察指标，选取复配比 (A) 、接种量 (B) 、发酵时间 (C) 为响应变量，每个因素设置低( (- - 1) 、中 (0) 、高3 (1)3 个水平，采用响应面分析法优化枯草芽孢杆菌和黑曲霉复配发酵蜂王幼虫工艺。响应面试验因素水平见表 1，设计及结果见表 2。
表 1 响应面试验因素水平表 Table1Responsesurfacetestfactorleveltable 表 2 响应面试验设计及结果 Table2Responsesurfaceexperimentaldesignandresults 2.2.2 回归模型分析及优化工艺条件确定与结果验证 利用 Design- - Expert10.0 统计软件将多肽得率和酶活力的实验结果分别进行二次回归拟合，并对二次多项回归方程进行方差分析，所建立的模型能比较准确地分析和预测蜂王幼虫液态发酵条件与多肽得率及酶活力的关系，并对正交试验结果进行方差分析，明确了 3 3 个 因素对多肽得率和酶活力影响的主次顺序。在此基础上，得到枯草芽孢杆菌和黑曲霉复配发酵蜂王幼虫制备活性肽的最佳工艺条件为：复配比2.426∶1，接种量 6.512%，发酵时间 57.553h，在此发酵条件下，多肽得率和酶活力的理论值是 15.624%和 128.38U/mL。为验证响应面的可行性以及为方便操作，将发酵参数设为复
配比 2.4∶1，接种量 6.5%，发酵时间 57.5h，在此条件下进行 3 次平行试验，测得平均多肽得率为(15.494±0.153)%，酶活力为(133.55±1.694)U/mL，均与理论预测值接近，由此说明用响应面回归模型拟合良好，对最佳发酵条件的优化具有一定的实用指导意义。
2.3 蜂王幼虫粗多肽的氨基酸测定 氨基酸组成是影响多肽抗氧化活性的重要因素之一 [18] 。采用氨基酸分析仪测定最优条件下发酵后的蜂王幼虫粗多肽冻干样品，氨基酸组成结果如表 3 所示，发现含量最高的是谷氨酸，达到 14.17%，其次是脯氨酸(11.13%)、天冬氨酸(10.09%)、赖氨酸(8.78%)以及亮氨酸(7.84%)。抗氧化氨基酸的含量达到 58.11%，疏水氨基酸为 47.2%。有研究指出多肽序列碳端相邻的氨基酸残基为疏水性较低的氨基酸(如谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸等)会提高多...
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