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饲料中动物源性成分检测技术争论进展
摘要: 饲料平安与动物生产、环境污染和人类健康亲密相关。动物废弃物进入饲料行业曾经弥补了蛋白质饲料不足的缺口,但却带来了新的问题。饲料中动物源性成分的定性或定量检测技术已成为国内外的争论热点，适用于各种样品、基于各种原理的方法和技术被开发出来。本文以组织学特征为基础的显微镜分析方法、以蛋白质和 DNA 为基础的免疫学和 PCR 分析方法、高效液相色谱法和近红外光谱法在动物源性饲料组分中的争论应用进展等方面做了综述,并对其进展趋势进行争论。
饲料平安已与动物生产、环境污染和人类健康 亲密相关。动物源性副产品因富含蛋白质、钙、磷等 养分成分而被应用于畜禽饲料中, 但现有的证据表 明, 在动物饲料中添加未经加热处理牛源性饲料或 感染过痒病因子的牛( 羊) 肉/ 肉骨粉( MBM) 后能够 引发和传播疯牛病( BSE)。
我们我国于 1999、2001 和 2004 年先后 下发了关于对动物源性饲料生产和管理的相关条例, 主要对反刍动物源性饲料组分、MBM、肉粉、骨 粉、血粉、动物内脏干粉和动物废弃物等使用做了严 格的规定。目前关于饲料中动物源性成分检测主要 以样品的组织学特性和品种特异性的生物标记物 ( 如蛋白质、DNA 和其他生物大分子等) 为对象, 其 中 PCR 技术进展快速, 已逐步被世界各国采纳。但 由于动物源性饲料组成上的简单性, 单一的 PCR 技 术仍不能克服耗时、效率低和假阳性等问题。因此, 争论并建立一种( 套) 快速、灵敏、牢靠的动物源性饲 料检测技术, 对于提高饲料质量、防止饲料掺假、控 制进口饲料平安和制订相关饲料法规等均具有重要 意义。
本文中动物源性成分 是指动物组织以及蛋和奶，包括肉类及其制品(含动物 脏器)、水生动物产品等，检测技术是指上述成分中蛋 白质和 DNA 等具有种间特异性物质的物种鉴定和含量分 析技术。该技术已成为爱护消费者权益和平安的重要技 术手段。
动物源性成分检测技术通常建立在对样品蛋白质、 DNA、脂肪酸等分子结构、序列或组成特异性分析的 基础上。涉及的技术手段包括酶联免疫、聚合酶链式
反应、电泳、色谱、生物传感分析等。本文依据分 析对象对动物源性成分检测技术进行分类论述，争论各 方法的优势与局限性及其进展趋势。
1. 1 以组织学为基础的检测技术 饲料显微镜分 析技术主要以组织学特性为基础, 借助立体显微镜 观看样品粗糙片段的形态学构造, 同时采用光学显 微镜观看细小颗粒的组织学构造, 从而区分不同组 织。显微镜技术以前主要用于产品品质认证( 纯 度) , 能够鉴别产品混合物中植物( 如面粉、香料和饲 料等产品) 或动物源性组分( 如颖苞、糊粉细胞、淀 粉、血块、骨碎片、羽毛碎片、毛发、肌肉纤维等) 。
BSE 消失以后, 一些我国和争论机构采用饲料显微 镜技术结合沉淀分析能够检测混合饲料中动物源性 饲料组分, 检测精度可达 0. 02%~ 0. 1%。该方法 主要过程如下: 样品粉碎到肯定的粒度后, 采用组合 显微镜( 放大倍数可达 400) 估量骨碎片与非骨碎 片( 肌肉碎片) 的比例。大部分的骨粉碎片通过沉淀 分析, 粉碎的样品悬浮在四氯乙烯中, 依据溶液的密 度区分颗粒( 闻伟刚等, 2004)（闻伟刚, 赵秀玲, 等. 进口饲料中牛、羊源成分的 PCR 同时检测 方法. 农业生物技术学报, 2004, 12(2): 167~169.）
。沉淀物中, 骨刺部分 采用分级筛收集后称重, 最终计算动物源性组分的 总重量。目前欧盟官方已将饲料显微镜分析技术作 为检测动物源性饲料成分的方法, 并且制定了严格 的操作规程 , 可以区分反刍动物饲料中肉及肉骨粉、喷雾 血粉、家禽废弃物和鱼粉( Ronaldo 等, 2004)（Ronaldo L, Sanches, Juarez F, et al. Inhouse validation of a method for detection of animal meals in ruminant feeds by microscopy. Food Control, 2004, 1~8.）
。
低倍镜下沉淀物的一般结构和颜色是鉴别肉骨 粉来源的第一信号。哺乳动物的骨碎片呈白色或淡黄 色, 禽类骨碎片的颜色发暗, 这些骨碎片都是不透亮
的, 而鱼类骨碎片要比哺乳动物和禽类的透亮
。高倍 镜下可以看到哺乳动物的骨碎片呈椭圆形近似圆形, 依据骨碎片的品质与透亮
度的不同, 用导管有时也能 看到, 有时环行骨板的方向也能看到。与哺乳动物相 比, 禽类的骨碎片更加尖锐, 腺窝更圆, 用导管看不 到。鱼类的骨呈扁平状, 其陷窝为拉长的梭形, 连成网 状, 而且依据鱼的种类不同也呈现肯定的多样性。这 些特征是最一般的特征, 在实际的检验中变化较大。
肉骨粉中会消失平滑肌或骨骼肌, 不管是哺乳动物、
禽类还是鱼类, 肌肉组织一般都被破坏成短的纤维, 其宽度依据处理的方法和动物的养分状况而不同。动 物肌纤维一般没有各自的明显特征, 肌纤维的消失与 否是判定饲料中是否消失动物源性成分的重要依据。
饲料中毛发、羽毛、蛋壳、鱼刺、鱼鳃的检出可以进一 步确定饲料中是否消失动物源性成分。欧盟已尝试通 过饲料显微镜学方法来进行定量测定。
饲料显微镜学方法具有样品制备量少、设施便 宜、简洁易行的优点, 但该方法费时、费劲, 对技术人 员的要求高, 结果与试验员的阅历相关性很大。不同 样品中所含有动物源性成分的来源多样, 低倍镜下颜 色的重叠比较大, 高倍镜下骨陷窝的重叠性比较大。
这要求显微镜分析师达到较高的专业水平。因此, 迫切需要建立一套新的、合适的鉴定标准。
1 基于蛋白特异性的检测技术 1.1 蛋白分子立体结构特异性 基于蛋白的鉴别技术大多以蛋白分子立体结构特异 性为基础，应用抗原-抗体特异性结合的原理建立，通 过检测标记信号的有无或强弱来推断目标成分的有无或 多少。该类技术具有操作简洁、特异性好、不需要大 型仪器设施的优点，简洁操作，可以进行大规模检测， 其核心技术是特异性抗原和抗体的筛选与制备。骨骼肌 中的肌钙蛋白 I(troponin I，tnI)具有高特异性和热稳定 性，是抱负的抗原之一，Liu 等 [1]（LIU Lihua, CHEN Furchi, DORSEY J L, et al. Sensitive monoclonal antibody-based sandwich ELISA for the detection of porcine skeletal muscle in meat and feed products[J]. Food Science, 2006, 71(1): M1-M6.）
以猪 tnI 为抗原制备了 两种单克隆抗体 Mab 8F10 和 Mab 5H9，Mab 8F10 能够 和全部的哺乳动物 tnI 而 Mab 8F10 只和猪 tnI 特异性反 应，用该组抗体开发的抗体夹心法能够检出鸡肉和牛肉 中掺杂的猪肉成分(检出限分别为 0.05%和 0.1%)、检出 大豆蛋白基料饲料中和肉骨粉中的肉成分(检出限分别为 0.05%和 1%)，而且样品经过 132℃、2h 的高温处理后 不影响检测效果。
基于蛋白分子立体结构特异性的检测方法也有局限 性，蛋白抗原打算簇的立体结构会受到多种环境因素影 响而转变，当检测加工过的成分时其特异性和精确
性会 大打折扣，此时需要有其他手段帮助检测[6]（van RAAMSDONK L W D, von HOLST C, BAETEN V, et al. New developments in the detection and identification of processed animal proteins in feeds[J]. Animal Feed Science and Technology, 2007, 133(1): 63-83.）
1.2 蛋白或肽谱特异性
基于蛋白的鉴别技术不仅仅局限于 ELISA 法为代表 的免疫学方法，应用液相色谱(LC)、高效液相色谱 (HPLC)、毛细管电泳(EC)或二维电泳分析样品蛋白和短 肽组成特点也能实现对样品中动物源性成分种类的识 别。例如，Ashoor 等 [7]（ASHOOR S H, MONTE W C, STILES P G. Liquid chromatographic identification of meats[J]. Journal Association of Official Analytical Chemists, 1988, 71(2): 397-403.）
开发了能够定性检测多种肉类 成分和定量检测鸡肉- 火鸡肉混合物成分的 LC 技术。
1.3 免疫学方法 肉骨粉一般都要经过高温、高压处理, 在这 个过程中很多蛋白质都发生了变性, 失去了抗原性和 水溶性, 这就给检测带来了困难。为了使用免疫学方 法鉴定动物成分的种类, 必需选择合适的动物成分作 为抗原, 其中肌肉组织的蛋白质具有较高的价值。目 前已发觉几种热稳定的蛋白质可以作为检测的目的 蛋白, 其中包括肌钙蛋白。免疫测定速度快、操作简洁, 不需要对工作人员进 行特别的培训; 并且特异性高, 能特异性地检测动物肌 肉, 而不与其它动物成分发生反应。ELISA 方法由于具 有特异性和灵敏度高的优点, 被广泛应用于食品和饲 料中的肉类品种鉴别; 并且 ELISA 不需要大型的科学 设施, 简洁操作, 可以进行大规模的检测。
2 基于 DNA 序列特异性的鉴别技术
因 此，采用 DNA 分子序列特异性开发定性、定量检测食 品、饲料中动物源性成分的方法和技术定已成为该领域 的争论焦点和主流，也是多数我国检测方法标准中指定 的检测方法。
2.1 DNA 杂交技术 Ebbehoj [16] EBBEHOJ K F, THOMSEN P D. Species differentiation of heated meat products by DNA hybridization[J]. Meat Science, 1991, 30(3): 221-234. 和 Thomsen 等应用 32 P-标记探针建立了检测生、熟牛肉中猪肉成分的 DNA 杂 交技术，同年开发了能够区分近亲物种成分(猴和人、 牛和绵羊或山羊)的条形-斑点杂交技术，检出限依据检 测对象亲缘关系的远近分布在 0.01%～10%区间。
2.2 基于 PCR 的动物源性成分检测技术 2.2.1 PCR-电泳 用物种间高异性引物对样品中的 DNA 进行 PCR 扩 增后琼脂糖电泳分别，通过观看是否有特异性条带消失 便可判定样品中是否含有相应的物种成分。该方法灵 敏、便捷、精确
，而且成本低廉，大量的详细方法和技术已被建立和开发，实现了对常见动物源性成分 (单一或混合物)的快速检测。
2.2.2 PCR-RFLP 限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)是应用物种间同源基因上特定限 制性内切酶位点特异性来实现对样品中动物源性成分来 源的识别。此方法简洁高效，无需设计物种特异性引 物，使用适合的通用引物即可，将扩增产物进行限制 内切酶反应，通过分析电泳图谱特征来判定物种来源， 但该方法适合鉴别单一成分样品，多物种混合物样品由 于电泳图谱较为简单，分析难度较高，结果牢靠性较 低。高琳等 [31] 高琳, 徐幸莲, 周光宏. 应用 PCR-RFLP 法鉴别肉制品中的猪和牛源性成分[J]. 南京农业高校学报, 2022, 31(2): 135-138. 建立了以动物线粒体 DNA 中 Cytb 区段保 守序列为靶序列的 PCR-RFLP 肉种检测方法，能从猪、 牛、羊、鸡、鸭、兔 6 种生肉及高压猪肉、猪肉火 腿肠等 7 种热加工肉制品中鉴别出猪源性和牛源性成 分。
2.2.3 PCR 测序 该方法是将特异性 PCR 反应得到的扩增产物分别纯 化后进行测序，并到基因组数据库(如 http://www.ncbi. nlm.nih.gov/)进行序列比对来确定待检样品所属的物种类 型，例如，Iijima 等 [37] IIJIMA K, SUZUKI K, OZAKI K, et al. DNA analysis for identification of food-associated foreign substances[J]. Journal of Food Quality, 2006, 29(5): 531-542. 建立了基于 18S rRNA 基因测 序的食品中动植物源性成分来源分析方法，Girish 等 [38] GIRISH P S, ANJANEYULU A S R, VISWAS K N, et al. Sequence analysis of mitochondrial 12S rRNA gene can identify meat species[J]. Meat Science, 2004, 66(3): 551-556. 建立了基于线粒体 12S rRNA 基因测序的鉴定方法。
2.2.4 随机引物的扩增 随机引物的扩增法(random amplified polymorphic DNA-PCR，RAPD)使用非特异性引物，能与模板上多 个位点结合而不是与某一限制性位点特异性结合，经过 PCR 扩增反应后可产生多个 PCR 产物，最有效结合的引
物在扩增过程中相互竞争而产生指纹，经过凝胶电泳可 产生物种特异性的图谱，以此来鉴定样品中的动物源性 成。RAPD 的优点在 于无需知道分析对象的全基因组序列，但其局限性也很 突出，如只适合分析单一成分样品，而对分析多成分 混合物会有肯定困难。
2.2.5 实时荧光 PCR 实时荧光 PCR 技术(real-time fluorescent polymerase chain reaction，RT-PCR)是一种在 PCR 反应体系中加入 荧光基团，采用荧光信号积累实时监测整个反应进程的 PCR 技术，并可通过标准曲线对未知模板进行定量分 析。该技术的消失使物种鉴别的灵敏性和精确
性都有所 提高，而且该技术无需进行电泳过程，避开了溴化乙 锭等有毒染料的使用，降低了试验对人体的危急系数。
其更大优势在于可通过设立外标物制作标准曲线实现对 样品中特定动物源性成分(DNA)含量的肯定定量，通过 分别加入特异性引物和通用引物实现特定成分的相对定 量，从而实现对肉类食品中掺假成分含量的测定和掺假 行为严峻程度的判定。其缺点是检测成本较高，包括 仪器和试验耗材。
2.3 环介导等温扩增技术 环介导等温扩增技术 [56] (loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种崭新的 DNA 扩增方法，与 一般 PCR 相比其最大的特点是采用具有链置换活性的 DNA 聚合酶(如 Bacillus
stearothermophilus
DNA polymerase) 在 65℃对样品中 DNA 进行等温扩增，而无 需进行温度变化循环，具有简洁、快速、特异性强的 特点。Ahmed 等 AHMED M U, HASAN Q, HOSSAIN M M, et al. Meat species iden-tific...