小干扰RNA,沉默miR-885,对结直肠癌SW620,细胞的影响及机制研究

周 彬 熊 聪 黄 河 祝 滔

据统计，结直肠癌的病死率仅次于肺癌、肝细胞癌和胃癌，且其发病率呈逐年升高趋势[1]。约50%的结直肠癌患者确诊时疾病已进展至中晚期，目前治疗方式以手术切除病变为主，辅以放射治疗、化学治疗和免疫治疗等，但术后患者仍有较高的复发率及转移风险[2]。因此，探究结直肠癌相关基因突变并寻找有效的靶向治疗方法对于改善患者的预后具有重要意义。miR-885 是miRNA 家族成员，在肝细胞癌、胃癌、肾细胞癌等恶性肿瘤中异常表达，其作用机制因肿瘤类型不同而存在较大差异，在肿瘤进程中起着抑癌或促癌作用[3-5]。目前关于miR-885 在结直肠癌细胞中作用的报道较少，且缺少相关机制的研究。本研究通过比较人正常结肠上皮细胞与结直肠癌细胞中的miR-885 表达水平，并探讨沉默miR-885 对结直肠癌SW620 细胞的影响及相关机制，以期为寻找新的结直肠癌生物靶向治疗方法提供参考。

1.1 实验材料和仪器

人正常结肠上皮细胞（NCM460 细胞）购自上海联迈生物工程有限公司；
结直肠癌SW620 细胞购自上海研谨生物科技有限公司；
miR-885 沉默质粒[miR-885 小干扰RNA（siRNA）]和阴性对照质粒（miR-NC）均由济南华维医药科技有限公司合成。实时荧光定量PCR 试剂盒购自美国Sigma 公司；
CCK-8 试剂盒购自日本同仁化学研究所；
兔抗人β-连环蛋白（β-catenin）、磷酸化β-catenin（p-β-catenin）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）和p-GSK-3β 一抗均购自美国Abcam 公司。MPR-A100 酶标仪购自日本ASONE 株式会社；
Transwell 小室购自北京冬璞泰和科技有限责任公司；
ChemiDocTMTouch 化学发光成像分析系统购自美国Bio-rad 公司。

1.2 细胞培养

NCM460 细胞培养于RPMI-1640 培养基，SW620细胞培养于DMEM 培养基。在培养基中补充100 mg/L 链霉素、100 U/mL 青霉素和10%胎牛血清，培养条件为5% CO2、37 ℃及饱和湿度。细胞融合度＞80%时，用0.25%胰蛋白酶消化、传代培养，取对数生长期的细胞进行后续实验。

1.3 NCM460 和SW620 细 胞 中miR-885 表 达 水 平检测

采用实时荧光定量PCR 法检测NCM460 和SW620 细胞中miR-885 的表达水平。取对数生长期的NCM460 和SW620 细胞，采用TRIzol 法提取细胞中的总RNA，测定纯度及浓度后，反转录成cDNA 并定量，按照试剂盒说明书操作。PCR 反应体系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 11.5 μL，10.0 μmol/L的上、下游引物各0.5 μL，DNA 模板1.5 μL，加入ddH2O 补充至25.0 μL。PCR 反应条件：90 ℃预变性5 min；
之后95 ℃变性12 s，64 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，共42 个循环。以U6 作为内参，采用2-△△Ct法计算miR-885 的相对表达量。实验重复3 次取均值。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4 细胞转染

取对数生长期的SW620 细胞接种至6 孔板（密度为1×105个/孔），待细胞融合度＞70%时，将细胞随机分为4 组：（1）空白组，只含SW620 细胞且未作处理；
（2）miR-NC 组，使用转染试剂（LipofactamineTM2000）将阴性对照质粒miR-NC 转染至SW620 细胞；
（3）miR-885 siRNA 组，使用转染试剂将miR-885 沉默质粒miR-885 siRNA 转染至SW620 细胞；
（4）miR-885 siRNA＋氯化锂（LiCl）组，使用转染试剂将miR-885 沉默质粒miR-885 siRNA转染至SW620 细胞，加入Wnt 信号通路的激动剂LiCl 并使其浓度为40 mmol/L。每组设置5 个复孔，培养48 h，然后采用实时荧光定量PCR 法检测4 组细胞中miR-885 的表达水平，以验证转染效果。

1.5 细胞增殖能力检测

采用CCK-8 法检测各组细胞的增殖能力。取1.4 小节中的各组细胞，接种至96 孔板（密度为1×103个/孔），加入含有10%胎牛血清的DMEM培养基，继续培养至24、48、72 h 时，加入CCK-8试剂（每孔20 μL），在保温箱中继续孵育4 h，以未添加细胞的空白孔作为对照，使用酶标仪检测490 nm 处的吸光度值（A 值），以A 值评估细胞的增殖能力。

1.6 细胞侵袭能力检测

采用Transwell 法检测各组细胞的侵袭能力。冰浴融化Matrigel 胶，使用PBS 将其稀释至质量浓度为1 mg/mL，以每孔50 μL 预先铺设于Transwell小室滤膜上，调整细胞密度为5.0×105个/mL 后加入Transwell 小室的上室，在下室中加入200 μL 含10%胎牛血清的培养基。常规培养48 h，取出杯底滤膜，使用无菌棉签擦去未穿膜细胞，PBS 冲洗，0.25%戊二醛固定25 min，0.1%结晶紫染色，洗涤后晾干。在滤膜中央及周围随机选取5 个不相邻的视野，计算每个视野内的侵袭细胞数。实验重复3次取平均值。

1.7 细胞中β-catenin 和GSK-3β 的蛋白表达水平检测

采用蛋白质印迹法检测各组细胞中β-catenin、p-β-catenin、GSK-3β 和p-GSK-3β 的蛋白表达水平。取1.4 小节中的各组细胞，预冷PBS 洗涤，加入蛋白裂解液450 μL（含1%蛋白酶抑制剂），冰浴裂解，离心取上清，备用。使用BCA 蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量。取40 μg 待测样本上样，加入缓冲液，混合均匀后沸水浴中加热5 min 至蛋白充分变性，12% SDS 聚丙烯酰氨凝胶电泳后湿转至膜，室温下加入封闭液封闭2 h，加入工作浓度为1∶500的兔抗人β-catenin、p-β-catenin、GSK-3β 和p-GSK-3β 一抗，4 ℃摇床孵育过夜，洗涤，之后加入工作浓度为1 ∶2 000 的山羊抗兔二抗，室温下孵育1 h，暗室中显影、定影，使用凝胶成像系统扫描，以目的蛋白条带灰度值/内参GAPDH 条带灰度值表示蛋白的相对表达量。

1.8 统计学处理

应用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.1 NCM460 和SW620 细 胞 中miR-885 的 表 达 水平比较

实时荧光定量PCR 法检测结果显示，NCM460细胞中miR-885 的相对表达量为0.58±0.07，显著低于SW620 细胞（1.43±0.19），2 组的差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 转染后各组细胞中miR-885 的表达水平比较

转 染48 h 后，空 白 组、miR-NC 组、miR-885 siRNA 组 和miR-885 siRNA＋LiCl 组 细 胞 中miR-885 的相对表达量分别为1.42±0.19、1.44±0.21、0.30±0.04 和0.75±0.09。与空白组、miR-NC 组比较，miR-885 siRNA 组细胞中miR-885 的相对表达量均显著降低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）；
与miR-885 siRNA 组比较，miR-885 siRNA＋LiCl 组细胞中miR-885 的相对表达量显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；
空白组与miR-NC 组细胞中miR-885 的相对表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 转染后各组细胞的增殖能力比较

CCK-8 法检测结果显示，与空白组、miR-NC组 比 较，miR-885 siRNA 组 转 染24、48、72 h 时A值均显著降低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）；
与miR-885 siRNA 组比较，miR-885 siRNA＋LiCl 组转染24、48、72 h 时A 值均显著升高，差异均有统计学意义（P均＜0.05）；
空白组与miR-NC 组在24、48、72 h 时的A 值差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表2。

表2 转染后各组24、48、72 h 时A 值比较

2.4 转染后各组细胞的侵袭能力比较

Transwell 法检测结果显示，空白组、miR-NC 组、miR-885 siRNA 组和miR-885 siRNA＋LiCl 组的侵袭细胞数分别为（126.40±19.87）个、（128.20±21.33）个、（32.60±5.48）个和（86.00±14.74）个。与空白组、miR-NC 组比较，miR-885 siRNA 组的侵袭细胞数均显著减少，差异均有统计学意义（P均＜0.05）；
与miR-885 siRNA 组比较，miR-885 siRNA＋LiCl 组的侵袭细胞数显著增多，差异有统计学意义（P＜0.05）；
空白组与miR-NC 组的侵袭细胞数差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.5 各 组 细 胞 中p-β-catenin/β-catenin 和p-GSK-3β/GSK-3β 的比较

蛋白质印迹法检测结果显示，与空白组、miRNC 组 比 较，miR-885 siRNA 组 细 胞 中p-β-catenin/β-catenin 均显著降低，p-GSK-3β/GSK-3β 均显著升高，差异均有统计学意义（P均＜0.05）；
与miR-885 siRNA 组 比 较，miR-885 siRNA＋LiCl 组 细 胞中p-β-catenin/β-catenin 显 著 升 高，p-GSK-3β/GSK-3β 显著降低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）；
空 白 组 与miR-NC 组 细 胞 中p-β-catenin/β-catenin 和p-GSK-3β/GSK-3β 的差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表3、图1。

图1 蛋白质印迹法检测各组细胞中p-β-catenin、β-catenin、p-GSK-3β 和GSK-3β 蛋白的表达水平

表3 各组细胞p-β-catenin/β-catenin 和p-GSK-3β/GSK-3β 的比较

结直肠癌的发生是由多个因素、多个机制综合作用而引起的，与抑癌基因、促癌基因及DNA修复机制相关基因发生突变有关[6-7]。除基因突变外，miRNA 表达改变也参与了结直肠癌的发生和发展过程。研究表明，miRNA 可作为预测结直肠癌患者预后的生物标志物[8-9]。miRNA 在进化上高度保守，可通过结合特定的信使RNA（mRNA），在转录水平上对基因表达进行负调节。目前研究表明，miRNA 在多种恶性肿瘤中作为促癌基因或者抑癌基因调控肿瘤进程，并可作为恶性肿瘤的潜在干预靶点[10-11]。

miRNA 可能通过调控细胞增殖、分化、凋亡等直接参与肿瘤进程，也可通过靶向调节促癌基因或抑癌基因间接调控肿瘤发生。研究表明，miR-885 在胶质母细胞瘤中异常高表达，其可通过海绵化发挥竞争性内源性RNA 的作用；
抑制miR-885-3p 表达可促进胶质母细胞瘤细胞的增殖和迁移，其可作为预后预测的潜在生物标志物[12]。本研究结果显示，结直肠癌SW620 细胞中miR-885 的表达水平显著高于NCM460 细胞；
且与空白组、miRNC 组比较，miR-885 siRNA 组转染24、48、72 h 时A 值均显著降低，侵袭细胞数均显著减少，这提示miR-885 在结直肠癌细胞中异常高表达，沉默其表达可减弱结直肠癌细胞的增殖和侵袭能力。Su 等[13]的研究发现，抑制miR-885-5p 表达可通过靶向SOCS5、SOCS6 和SOCS7 基因，抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移及上皮间质转化（EMT），与本研究结果相符。

Wnt/β-catenin 信号通路在正常成熟细胞中处于关闭状态，细胞质中β-catenin 通过与GSK-3β 形成蛋白复合体发生磷酸化，最终被蛋白酶水解；
当Wnt/β-catenin 信号通路被异常激活时，Wnt 蛋白在蓬乱蛋白的作用下导致GSK-3β 失活，使β-catenin不能发生磷酸化而大量累积在细胞质中并转移至细胞核，在T 细胞因子/淋巴样增强因子的作用下激活下游转录过程及促癌基因表达，从而促进肿瘤发生[14-15]。Cho 等[16]的研究表明，5-氟尿嘧啶与Wnt/β-catenin 信号通路抑制剂联合应用可作为改善结直肠癌预后的重要策略，这提示该信号通路可能是结直肠癌的潜在治疗靶点。本研究结果显示，与空白组、miR-NC 组比较，miR-885 siRNA 组细胞中p-β-catenin/β-catenin 降低，p-GSK-3β/GSK-3β 升高，且加入LiCl 可减弱miR-885 siRNA 对结直肠癌细胞增殖、侵袭能力的抑制作用，这提示siRNA 沉默miR-885 的作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin 信号通路有关。

综上所述，siRNA 沉默miR-885 可减弱结直肠癌SW620 细胞的增殖、侵袭能力，其作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin 信号通路有关。miR-885 对结直肠癌细胞的影响可能通过多种机制发挥作用，今后仍需进一步探讨。

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