口腔扁平苔藓组织中IL-35,表达水平与外周血CD4+CD25+Treg,的相关性

刘婷婷，刘冰，杨利杰

（郑州大学第一附属医院口腔内科，河南 郑州 450002）

扁平苔藓是由不明原因引起的累及黏膜、毛囊、皮肤等慢性炎症性疾病，临床表现为紫红色、多角形扁平丘疹和斑块，大多分布于手腕、前臂、颈部和远端下肢[1]。分布于黏膜上的扁平苔藓多为口腔扁平苔藓（Oral lichen planus，OLP），主要表现为口腔内舌部、唇部、牙龈和颚部刺痛[2]，不仅影响口腔部位，还伴有皮肤以及甲部病损，长期病损有恶变现象，但几率较低，仅为0%～2%左右[3]。依据病损处黏膜状况可将OLP 分为糜烂性和非糜烂性两大类，糜烂性多表现为白色糜烂状黏膜，偶见充血。非糜烂型指病损处未出现充血及糜烂，一般为白色水疱、斑块及条纹样[4]。目前广泛认为免疫因素与OLP 的发病有关，其中又以T 淋巴细胞免疫反应为主[5]。CD4+CD25+调节性T 细胞（Regulatory T cells，Treg）是T 淋巴细胞亚群重要之一，CD4+CD25+Treg 细胞可占CD4+T 淋巴细胞的5%～10%左右[6]，在维持自身免疫耐受中发挥关键作用，参与自身及外来抗原介导的细胞免疫应答反应。叉状头转录因子P3 （Forkhead box P3，FOXP3）是Treg 细胞的标志基因，也是CD4+CD25+Treg 细胞生长和发育的重要转录调控因子，可作为CD4+CD25+Treg 细胞的特异性标志物。白介素-35（Interleukin35，IL-35）是近些来年新发现的白介素-12（Interleukin12，IL-12）家族中的一员，由IL-12 p35和EB 病毒诱导蛋白3（Epstein-Barr virus-induced gene3，EBI3）组成，通过调控Treg 细胞、辅助性T细胞17（T helper cell 17，Th17）细胞分化和TH17/Treg 平衡，影响免疫反应[7]。本次实验探究OLP 患者组织内IL-35 和CD4+CD25+Treg 水平的变化，并分析其与OLP 发病的关系。

1.1 一般资料 收集2016 年9 月至2018 年9 月期间我院口腔科收治的口腔扁平苔藓患者38 例，设为OLP 组，其中男性患者10 例，女性28 例，年龄为18～68 岁，平均年龄为（45.12±11.38）岁，其中糜烂型OLP 患者13 例，非糜烂型OLP 患者25例。另选同期来我院体检的健康人群20 例作为对照组，男性7 例，女性13 例，年龄为19～66 岁，平均年龄为（46.05±12.11）岁。对比OLP 组和对照组人群性别、年龄等基础资料，无统计学差异，两组数据具有可比性。

1.2 纳入排除标准 纳入标准：OLP 组患者均符合口腔扁平苔藓诊断标准[8]，并结合临床症状及病理活检后确诊；
入院前未接受过任何OLP 治疗方案；
OLP 组和对照组年龄均为18 岁以上，临床资料完善，自愿参与本次研究者。

排除标准：口腔修复材料及药物等引起的苔藓样皮疹；
患有系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病者；
患有牙周炎、口腔白斑等其他口腔疾病；
30天内接受过抗生素及免疫治疗者；
患有高血压、糖尿病等基础疾病者；
18 岁以下未成年者；
临床资料不全，不愿参与本次研究者。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 抽取OLP 患者及健康对照者晨起空腹外周静脉血各10 mL，将其中5 mL 置于含有EDTA 的抗凝管中，轻摇试管充分混合，采用离心机 （厂家：上海能共实业有限公司；
规格：BXTGL16M）以3 000 rpm 转速将血液样本高速离心10 min，使其分为血浆层（上层）和红细胞层（下层），小心吸去上层血浆，待酶联免疫吸附试验时检测炎症因子的含量。以生理盐水稀释下层红细胞，将稀释后红细胞按1:1 比例加入淋巴细胞分离液中，注意不破坏分界层，按照淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque（厂家：美景生物科技有限公司；
货号：IAE-1）说明操作进行，离心机以1 800 rpm 转速4℃下高速离心20 min，当观察到试管中呈现明显的4 层结构时，小心吸取第二层（即白膜层）中的外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMCs），并向含有PBMCs 细胞的试管中加入生理盐水重悬，保存至-40℃条件下，待后续荧光定量PCR 检测细胞中mRNA 的表达。另外5 mL全血进行CD4+CD25+Treg 细胞的检测。此外，分别收集OLP 患者口腔扁平苔藓组织标本和健康对照者正常口腔上皮黏膜标本，10%福尔马林固定后进行免疫组织化学检测。

1.3.2 荧光定量PCR 采用Trizol 试剂 （上海邦景实业有限公司）提取PBMCs 细胞中的总RNA，取2 μL 总RNA，与随机引物、三磷酸脱氧核糖核苷、Rnase-free 水各1 μL 充分混合后，PCR 仪孵育，再与第一缓冲区4 μL、M-MLV 反转录酶1 μL、RNA酶抑制剂1 μL 混匀后45℃下孵育50 min，70℃下孵育5 min，将总RNA 逆转录成cDNA。2%琼脂糖凝胶110 V 凝胶电泳30 min，与SGYR super Mix、上下游引物、双蒸馏水、荧光定量PCR 参比染料（北京百奥莱博科技有限公司）95℃预变性3 min。94℃反应30 s，61℃反应30 s，72℃反应60 s，共循环40 次，采用MA-6000 荧光定量PCR 仪（济南泰医生物技术有限公司）按照2-ΔΔCt方法[9]分析以GAPDH 作为内参时EBI3、IL-12 p35、FOXP3 的相对mRNA 表达，上下游具体引物设计，见表1。

表1 上下游引物序列

1.3.3 酶联免疫吸附法 采用酶联免疫吸附法检测OLP 患者和健康者经高速离心后上层血浆中IL-35、白介素-10（Interleukin-10，IL-10）、白介素-17（Interleukin-17，IL-17）和转化生长因子β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）的含量，将提取的各组血清从-40℃条件下取出并稀释，分别以IL-35、IL-10、IL17、TGF-β1 试剂盒（均购自卡上海迈舒生物科技有限公司）按照说明书操作检测各组患者血清炎症因子水平。

1.3.4 流式细胞仪检测外周血CD4+CD25+Treg 细胞水平 取5 mL 健康者和OLP 患者全血，分别加入荧光PE 标记的CD4 和FITC 标记的CD25 抗体，以γ1、γ2 作为阴性对照，均在室温条件下共同培养30 min，再以红细胞裂解液进行裂解，缓冲液多次洗涤后高速离心，弃上清液，将细胞悬液重悬于缓冲液中，采用流式细胞仪（厂家为上海寰熙医疗器械有限公司；
型号为BriCyte E6）检测CD4+T 细胞和CD4+CD25+Treg 细胞水平。

1.4 统计学分析 统计学处理用SPSS 22.0 进行，计量资料采用（±s）表示，t 检验。计数资料率用（n，%）表示χ2检验。采用Pearson 法进行相关性分析，P<0.05 为差异有统计学意义。

2.1 两组外周血EBI3、IL-12 p35、FOXP3 的mR-NA 表达 荧光定量PCR 检测OLP 组和对照组PBMCs 细胞中EBI3、IL-12 p35、FOXP3 的mRNA表达，结果发现，与对照组相比，OLP 组EBI3、IL-12 p35、FOXP3 的mRNA 均显著上调（P<0.05），见图1。

图1 EBI3、IL-12 p35、FOXP3 的mRNA 表达

2.2 血清IL-35、IL-10、IL17、TGF-β1 的水平 与对照组相比，OLP 组患者血清IL-35、IL-10、IL17、TGF-β1 含量显著均上调，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

表2 血清IL-35、IL-10、IL17、TGF-β1 的含量（±s）

表2 血清IL-35、IL-10、IL17、TGF-β1 的含量（±s）

组别IL-35（pg/mL）IL-10（pg/mL）IL17（pg/mL）TGF-β1（ng/mL）对照组（n=20）OLP 组（n=38）tP 163.21±52.43 197.62±61.22 2.133 0.037 129.24±21.41 318.46±25.87 28.016＜0.001 190.23±48.76 287.64±62.17 6.083＜0.001 37.84±13.97 49.23±17.25 2.543 0.014

2.3 两组外周血CD4+CD25+Treg 细胞水平 与对照组相比，OLP 组患者外周血CD4+T 细胞和CD4+CD25+Treg 细胞水平均显著下降，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。

表3 两组外周血CD4+CD25+Treg 细胞水平（±s，%）

表3 两组外周血CD4+CD25+Treg 细胞水平（±s，%）

组别CD4+CD25+TregCD4+T对照组（n=20）OLP 组（n=38）χ2P 7.94±1.22 2.36±0.64 22.935＜0.001 36.85±4.72 21.03±5.11 11.497＜0.001

2.4 组织IL-35 和外周血CD4+CD25+Treg 与OLP患者临床病理特征的关系 IL-35 和CD4+CD25+Treg 水平与患者基底细胞变性程度有关（P<0.05），而与性别、年龄、病程、疾病类型和淋巴细胞浸润无关（P>0.05），见表4。

表4 组织IL-35 和外周血CD4+CD25+Treg 与OLP 患者临床病理特征的关系（±s）

表4 组织IL-35 和外周血CD4+CD25+Treg 与OLP 患者临床病理特征的关系（±s）

临床资料因素nIL-35（pg/mL）tP性别男女10 28 195.67±60.28 198.95±64.23 0.128 0.899 CD4+CD25+Treg（%）2.11±0.61 2.45±0.52 t 1.697 P 0.098年龄病程疾病类型淋巴细胞浸润程度基底细胞变性程度＞40 岁≤40 岁＞6 个月≤6 个月糜烂型非糜烂型1 分2 分3 分1 分2 分3 分16 22 18 20 13 25 7 16 15 16 18 4 186.47±53.92 205.62±61.08 183.62±67.85 209.92±70.28 211.35±68.74 190.43±75.26 170.08±75.31 189.34±63.28 219.81±68.95 181.91±42.49 195.24±70.82 271.26±62.71 1.001 1.171 0.836 1.502 3.629 0.323 0.249 0.409 0.237 0.037 2.30±0.63 2.41±0.58 2.32±0.59 2.39±0.48 2.41±0.63 2.34±0.57 2.40±0.45 2.38±0.51 2.32±0.48 2.59±0.42 2.25±0.54 1.94±0.30 0.557 0.403 0.347 0.087 3.934 0.581 0.689 0.731 0.917 0.029

2.5 IL-35 与CD4+CD25+Treg 相关性分析 对OLP患者口腔扁平苔藓组织IL-35 与外周血CD4+CD25+Treg 水平进行相关性分析，IL-35 与CD4+CD25+Treg 的水平呈正相关（r=0.3644，P<0.05），见图2。

图2 IL-35 与CD4+CD25+Treg 相关性分析

口腔扁平苔藓是多发于中老年女性的慢性炎症性口腔黏膜疾病，多见于口腔黏膜、舌部和牙龈部位，且口腔病变始终呈双侧对称分布[11]。过往研究指出，OLP 还是一种T 淋巴细胞功能障碍引起的局限性自身免疫性疾病，虽不具备传染性，但存在恶性病变可能[12]。现阶段多通过检测患者自身抗体、血清同型半胱氨酸水平对患者进行病情评估[13]，由于OLP 是免疫介导的疾病，临床治疗方式以皮质类固醇为主。CD4+CD25+Treg 细胞是T 淋巴细胞重要亚群之一，负责调控自身免疫反应，参与红斑狼疮等自身性免疫疾病的发生发展[14]。本次研究发现，CD4+CD25+Treg 细胞和IL-35 在OLP 患者外周血和黏膜组织中异常表达，且与临床病理特征有关。

IL-35 是IL-12 超家族的一员，具有调控调节性B 细胞（Breg）和调节性T 细胞（Treg）分化的作用，通过抑制淋巴T 细胞增殖和Breg 细胞产生IgE 抗体，诱导Th2 细胞因子的产生，发挥免疫抑制活性。最新的研究已经证实，Treg 细胞可分泌IL-35，并通过IL-35 的两个重要亚基IL-12 p35和EBI3 的合成与释放，参与机体免疫反应，在银屑病、类风湿性关节炎等自身免疫疾病中发挥重要的免疫抑制作用[15]。本次实验发现，IL-35 的亚基IL-12 p35 和EBI3 在OLP 患者外周血单个核细胞和口腔黏膜组织中的表达均显著高于正常人群。推测原因可能与OLP 患者发病时机体免疫耐受平衡被打破有关，Treg 细胞增多但伴有功能缺陷和受损，释放更多的IL-10、TGF-β1、IL-35 等细胞因子的来弥补功能缺陷导致的免疫抑制作用下降[16]。本次研究结果还显示，口腔扁平苔藓癣组织中IL-35 水平与患者基底细胞变形程度有关，随着OLP患者病情的进展，基底细胞变形程度逐渐加剧，IL-35 水平显著增强，以补偿和维持免疫抑制效应。

Treg 细胞主要由CD4+CD25+Treg 细胞、Trl 细胞和Th3 细胞等组成，其中CD4+CD25+Treg 细胞被认为是与免疫反应激活有关的重要亚群，参与调控肿瘤免疫、移植免疫和感染性免疫等免疫应答[17]。FOXP3 是CD4+CD25+Treg 细胞的特异性标记分子，不仅可调控T 淋巴细胞增殖和分化，同时也是Treg 发挥其免疫抑制活性的关键因子。IL-10、IL17和TGF-β1 是反映炎症程度的关键指标，其含量越高，代表炎症反应被激活，机体炎症水平越高。本次研究发现，CD4+CD25+Treg 细胞的特异性标志物FOXP3 在OLP 患者组织和外周血中表达均显著上调，与对照组相比，口腔扁平苔藓患者外周血CD4+CD25+Treg 水平显著降低，且其水平的变化与患者基底细胞变形程度有关。这表明OLP 患者体内存在明显的Th17/Theg 免疫失衡，Th17 细胞分泌大量的IL17，结合其受体活化核因子-κB 等信号通路、加速IL-10、TGF-β1 等炎症因子的分泌和释放[18]，引起炎症反应。因此，CD4+CD25+Treg 细胞参与了OLP 的病情进展过程，介导炎症进程，增强Theg 免疫抑制活性，维持Th17/Theg 免疫稳态平衡。

通过对OLP 组织内IL-35 和CD4+CD25+Treg细胞水平进行检测，分析其在OLP 患者体内表达的相关性，结果发现，IL-35 与CD4+CD25+Treg 的水平呈正相关（r=0.3644，P<0.05）。FOXP3 是Treg细胞发挥免疫抑制作用必不可少的分子，而IL-35的重要亚基EBI3 被证实是FOXP3 的下游靶点之一[19]，IL-35 也同样仅表达于Treg 细胞中，二者共同作用诱导CD4+CD25+Treg 发挥免疫抑制作用，IL-35 和CD4+CD25+Treg 均在OLP 患者体内发挥促炎作用[20]，激活炎症反应，加速炎症介质IL-35、IL-10、IL17、TGF-β1 的释放，引起OLP 疾病进展[21]，因此，IL-35 和CD4+CD25+Treg 在OLP 患者体内呈正相关关系。

综上所述，IL-35 和CD4+CD25+Treg 均在OLP患者中高表达，激活炎症反应和免疫抑制效应，二者呈明显正相关，其表达水平的上调也与患者病情进展有关，提示OLP 患者体内存在免疫失衡，IL-35 和CD4+CD25+Treg 异常表达参与了OLP 发生发展，为临床治疗OLP 提供了更多理论依据。

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