余 丹, 陈彰强, 彭晓红
武汉市第四医院麻醉科,武汉 430033
缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是由于围生期新生儿缺氧缺血而导致的脑损伤,可造成患儿脑性瘫痪、认知功能障碍、癫痫等神经后遗症[1-2]。右美托咪定(Dexmedetomidine,Dex)是一种选择性α肾上腺素能受体激动剂,具有镇静、镇痛、稳定血流且无呼吸抑制的作用。研究显示,右美托咪定对缺血缺氧新生大鼠脑损伤具有保护作用[3],还可减轻老龄大鼠术后认知功能障碍[4]。沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)是一种组蛋白脱乙酰化酶,可通过去乙酰化作用参与氧化应激、炎症反应、神经保护等作用。研究显示SIRT1可激活下游脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF),BDNF参与神经存活与发生,其水平升高可改善学习记忆功能障碍[5-6]。研究显示,SIRT1通过调节HMGB1表达进而调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路,参与抗神经炎症反应,在新生儿HIBD中发挥神经保护作用[7]。研究表明,右美托咪定通过调节SIRT1信号通路,减轻创伤性脑损伤大鼠病理损害,起保护神经的作用[8]。右美托咪定对HIBD引起的认知功能障碍的作用及机制尚不清楚,本研究在验证右美托咪定保护脑HIBD损伤的基础上,观察右美托咪定对HIBD引起认知功能障碍及SIRT1/BDNF信号通路的影响,初步探讨其作用机制。
1.1 实验动物
7日龄SPF级新生SD大鼠,体重12～16 g,购自武汉大学动物实验中心,实验动物生产许可证号:SCXK(鄂)2019-0004。
1.2 主要药物和试剂
盐酸右美托咪定注射液(2 mL:0.2 mg)购自江苏恩华药业股份有限公司;SIRT1抑制剂EX527(E7034)购自Sigma公司;One-step TUNEL Apoptosis Kit(E-CK-A321)购自Elabscience;通用SP检测试剂盒(SP0041)、TTC染色液(G3005)购自Solarbio公司;兔抗突触后致密蛋白-95(postsynaptic dense protein-95,PSD95)(AF1096)、SIRT1(ab189494)、cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)(AF1018)、pCREB(AF5785)、BDNF(AF1423)抗体购自Beyotime公司。
1.3 实验方法
1.3.1 动物模型复制及分组 采用改良Rice法[9]复制HIBD大鼠模型:新生大鼠吸入3%异氟烷麻醉,沿颈部正中切口,分离左颈总动脉,结扎并缝合伤口,将大鼠置于缺氧环境中(92% N2+8% O2)4 h,对照组仅游离颈总动脉,不做缺氧缺血处理。
实验大鼠随机分为对照组(Control组)、模型组(HIBD组)、Dex组、Dex+EX527组,造模后,Dex组使用100 μg/kg右美托咪定腹腔注射给药,给药剂量参照文献[6];Dex+EX527组使用100 μg/kg右美托咪定腹腔注射给药与10 μg EX527术前侧脑室注射给药;Control组与HIBD组给予等量的生理盐水。
大鼠缺氧4 h后,对大鼠进行Zea Longa评分[10],0分表示神经症状正常,1～3分表示造模成功,剔除0、4、5分大鼠,随机补充保证每组10只大鼠。
1.3.2 Morris水迷宫实验与空间探索实验 给药结束后,以Morris水迷宫[11]检验大鼠学习记忆功能。保持水温25℃左右,实验第1天为适应性训练,剔除有运动障碍的大鼠,实验第2(D2)、4(D4)、6(D6)天的同一时间点从水池4个象限点放入大鼠,记录大鼠2 min内登上平台时间;若在2 min内大鼠未找到平台,则人为引导大鼠找到平台并记录时间为2 min。第6天水迷宫实验结束后移走平台,将大鼠从水池4个象限点放入水中,记录大鼠在2 min内穿越平台次数和穿越平台的时间。
1.3.3 TTC染色检测脑梗死面积 水迷宫实验结束后,每组随机取5只大鼠处死,取脑组织冰冻后切成厚度为2 mm的切片,选同一部位切片采用4%多聚甲醛固定及TTC染色法染色,采用Image J 1.8.0软件分析切片脑梗死面积,即该切片切面的脑梗死面积占总面积的百分比,其中正常脑组织显红色,梗死组织显白色。
1.3.4 TUNEL染色检测神经元凋亡 取各组大鼠脑组织同一部位冰冻切片,根据One-step TUNEL Apoptosis Kit说明书进行TUNEL染色,DAPI复染细胞核,荧光显微镜下观察神经元凋亡。随机选择5个视野,计算平均凋亡率,神经元凋亡率=显示绿色荧光细胞数/细胞总数×100%。
1.3.5 免疫组化检测海马组织PSD95表达 另外5只大鼠处死后取海马组织,一部分组织-80℃保存,另一部分组织4%多聚甲醛固定,石蜡包埋后切片,免疫组化法检测海马组织PSD95表达,随机选择3个视野,显微镜下观察海马CA1区染色阳性细胞数。
1.3.6 Western blot检测大鼠海马组织SIRT1、CREB、pCREB、BDNF蛋白表达 各组剩余海马组织用液氮研磨,加入RIPA裂解液离心提取总蛋白,取适量样品煮沸变性后经电泳、转膜,加入兔抗鼠SIRT1、CREB、pCREB、BDNF一抗稀释液,4℃孵育过夜,加二抗,显色曝光,以β-actin为内参分析目的蛋白相对表达量。
1.4 统计学方法
2.1 右美托咪定对HIBD大鼠认知功能的影响
与Control组比较,HIBD组大鼠在D2、D4、D6逃避潜伏期显著延长(均P<0.05),空间探索时间明显增加,穿越平台次数明显减少(均P<0.05);与HIBD组比较,Dex组大鼠在D2、D4、D6逃避潜伏期明显缩短(均P<0.05),空间探索时间明显减少,穿越平台次数明显增加(均P<0.05);与Dex组比较,Dex+EX527组大鼠在D2、D4、D6逃避潜伏期明显延长(均P<0.05),空间探索时间明显增加,穿越平台次数显著减少(均P<0.05),见表1。
表1 各组大鼠水迷宫实验结果比较Table 1 Comparison of the water maze test results of rats in each
2.2 右美托咪定对HIBD大鼠神经功能及脑梗死面积的影响
Control组大鼠脑组织没有出现梗死现象,神经功能评分为0;HIBD组大鼠脑组织白色区域增多,说明有明显的梗死灶形成,其脑梗死面积与神经功能评分均较Control组显著增加(均P<0.05);与HIBD组比较,Dex组大鼠脑组织白色区域减少,梗死面积与神经功能评分显著减少(均P<0.05);与Dex组比较,Dex+EX527组大鼠脑梗死面积与神经功能评分显著增加(均P<0.05),见图1。
与Control组比较,*P<0.05;与HIBD组比较,#P<0.05;与Dex组比较,△P<0.05图1 各组大鼠神经功能评分及脑梗死面积Fig.1 Neurological function score and cerebral infarction area of rats in each group
2.3 右美托咪定对HIBD大鼠海马神经元凋亡的影响
TUNEL染色凋亡神经元显示绿色,与Control组比较,HIBD组大鼠海马神经元凋亡率显著升高(P<0.05);与HIBD组比较,Dex组大鼠海马神经元凋亡率显著降低(P<0.05);与Dex组比较,Dex+EX527组大鼠海马神经元凋亡率显著升高(P<0.05),见图2。
与Control组比较,*P<0.05;与HIBD组比较,#P<0.05;与Dex组比较,△P<0.05图2 各组大鼠神经元凋亡(TUNEL染色,×200)Fig.2 Neuron apoptosis of rats in each group(TUNEL,×200)
2.4 右美托咪定对HIBD大鼠海马组织PSD95表达的影响
免疫组化结果显示,与Control组比较,HIBD组大鼠海马组织PSD95阳性表达率显著降低(P<0.05);与HIBD组比较,Dex组大鼠海马组织PSD95阳性表达率显著升高(P<0.05);与Dex组比较,Dex+EX527组大鼠海马组织PSD95阳性表达率显著降低(P<0.05),见图3。
与Control组比较,*P<0.05;与HIBD组比较,#P<0.05;与Dex组比较,△P<0.05图3 各组大鼠海马组织PSD95表达(免疫组化染色,×100)Fig.3 Expression of PSD95 in hippocampus of rats in each group(Immunohistochemical staining,×100)
2.5 右美托咪定对HIBD大鼠海马组织SIRT1、pCREB、BDNF蛋白表达的影响
Western blot结果显示,与Control组比较,HIBD组大鼠海马组织SIRT1、BDNF蛋白表达水平及pCREB/CREB显著降低(均P<0.05);与HIBD组比较,Dex组大鼠海马组织SIRT1、BDNF蛋白表达水平及pCREB/CREB显著升高(均P<0.05);与Dex组比较,Dex+EX527组大鼠海马组织SIRT1、BDNF蛋白表达水平和pCREB/CREB显著降低(均P<0.05),见图4。
1:Control组;2:HIBD组;3:Dex组;4:Dex+EX527组;与Control组比较,*P<0.05;与HIBD组比较,#P<0.05;与Dex组比较,△P<0.05图4 各组大鼠海马组织SIRT1、CREB、pCREB、BDNF蛋白表达Fig.4 Expression of SIRT1,CREB,pCREB and BDNF protein in hippocampus of rats in each group
HIBD是引起新生儿死亡和残疾的主要原因,高达25%的患儿遗留永久性神经后遗症,即使经过低温治疗仍有后遗症的发生[12]。缺血缺氧是HIBD重要的病理生理过程,可引起脑组织发生病理变化,如梗死与神经元凋亡,其中海马组织CA1区是学习、记忆的重要区域,组织损伤可引起认知功能障碍[13]。PSD95为神经细胞骨架蛋白,在神经功能与发育方面有重要作用,可反映学习记忆功能,在认知功能障碍的大鼠海马中PSD95表达水平降低[14]。本研究结果显示,给予HIBD模型大鼠右美托咪定治疗后,大鼠逃避潜伏期明显缩短,空间探索时间明显减少,穿越平台次数明显增加,脑梗死面积与神经功能评分、神经元凋亡率显著降低,海马组织PSD95阳性表达率升高,表明右美托咪定可减轻HIBD大鼠神经损伤与认知功能障碍。
右美托咪定具有抗焦虑、镇痛、稳定血流动力学等作用,在改善缺血缺氧引起脑损伤和神经功能方面发挥重要作用。另外,右美托咪定还可改善气道的压力和顺应性,无呼吸抑制作用[15]。Gao等[16]研究显示,右美托咪定可通过线粒体途径抑制神经元凋亡,介导神经珠蛋白表达而发挥对缺氧复氧模型大鼠的神经保护作用。杨悦等[17]研究显示,右美托咪定可激活Wnt/GSK-3β/β-链蛋白信号通路抑制七氟醚诱导的大鼠神经元凋亡,并改善大鼠认知功能障碍。本研究结果与既往报道结果类似,且本研究还发现,右美托咪定改善HIBD大鼠神经损伤及认知功能障碍的作用可被SIRT1抑制剂逆转,推测右美托咪定可能通过激活SIRT1信号通路减轻HIBD引起的大鼠认知功能障碍。研究显示,SIRT1信号通路在缺氧缺血性脑损伤模型新生大鼠认知功能障碍中发挥重要作用[18]。
SIRT1是NAD+依赖的去乙酰化酶,在脑组织中主要表达于海马神经元,通过去乙酰作用参与氧化应激、炎症反应,在参与神经保护作用方面发挥重要作用[19]。BDNF是神经营养因子,参与突触的正常生长、发育和可塑性,对缺血缺氧性脑损伤的神经元具有保护作用,SIRT1可通过调节CREB的表达进而影响BDNF的表达,BDNF是CREB最重要的靶蛋白之一,CREB的磷酸化(pCREB)可增强BDNF的转录激活,在学习、记忆和情绪调节中发挥重要作用[20]。SIRT1/BDNF信号通路激活可改善血管性认知障碍大鼠的学习记忆功能和脑缺血再灌注大鼠的认知功能[21-22]。本研究结果显示,使用右美托咪定治疗HIBD模型大鼠后,HIBD大鼠海马组织SIRT1、pCREB、BDNF蛋白表达水平显著升高,提示右美托咪定可能激活SIRT1/BDNF信号通路;而使用SIRT1抑制剂EX527可显著下调SIRT1、pCREB、BDNF蛋白表达水平,并且逆转右美托咪定HIBD大鼠脑组织损伤及认知功能的抑制作用,表明右美托咪定可通过激活SIRT1/BDNF通路保护HIBD大鼠脑神经损伤,改善认知功能障碍。右美托咪定是通过何种途径影响SIRT1的表达,仍需做深入研究。研究显示,AMPK是SIRT1的激活剂,同时SIRTl的过度表达可激活下游的AMPK,表明二者可通过能量代谢发挥独立或协同作用[23]。右美托咪定可通过调节AMPK,影响SIRT1表达,进而影响pCREB,增强BDNF的转录激活。研究显示[24],行肝叶切除术的患者在麻醉之后分别以0.3 μg/(kg·h)或0.6 μg/(kg·h)的的速率静脉泵注右美托咪定,直至手术完成,患者发生术后谵妄和术后认知功能障碍的比例较对照组显著降低,提示右美托咪定对改善认知功能障碍有一定临床应用意义。
综上所述,右美托咪定可通过激活SIRT1/BDNF信号通路,改善HIBD新生大鼠神经功能损伤与认知功能障碍。本研究为HIBD引起的认知功能障碍的治疗提供了新思路。
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