李 睿, 杜心灵
华中科技大学同济医学院附属协和医院心脏大血管外科,武汉 430022
钙化性主动脉瓣疾病(calcific aortic valve disease,CAVD)是一种与年龄高度相关的退行性疾病,主要表现为主动脉瓣瓣叶增厚、钙化导致主动脉瓣狭窄,引起显著的血流动力学变化[1]。流行病学调查研究显示,50～69岁人群中CAVD发病率约为0.3%;而70岁以上人群中,CAVD发病率约高达1%[2]。随着我国人口老龄化程度逐渐加重,CAVD已逐渐成为严重的社会负担。目前,CAVD尚无有效的药物治疗手段,仍以手术换瓣治疗为主。机械瓣置换术后需长期服用华法林抗凝治疗,具有出血及栓塞风险;生物瓣因其易钙化、衰败,具有再次手术可能[3]。因此,深入研究主动脉瓣钙化病理机制,寻找可能的药物干预靶点,对CAVD预防及治疗具有重要意义。
主动脉瓣由内皮细胞、间质细胞,以及细胞外基质构成[4]。研究表明,CAVD发生发展主要分为3个阶段。初期表现为氧化型低密度脂蛋白水平升高、机械/剪切应力变化、钙磷代谢紊乱等因素引起瓣膜内皮细胞损伤、内皮下脂质沉积、炎症细胞浸润,瓣膜发生纤维化、增厚;进展期以主动脉瓣间质细胞(aortic valve interstitial cells,AVICs)向成骨样细胞分化为标志,逐渐形成微小钙结节;终末期则是钙盐大量沉积,瓣膜狭窄,导致严重血流动力学改变[5]。AVICs成骨样分化是一直以来瓣膜钙化研究的焦点,是寻找药物治疗靶点干预最主要的病理进程之一[6]。虽然目前研究对CAVD发生发展有了一定认识,但AVICs成骨样分化机制仍不明确。
乳脂球表皮生长因子8(milk fat globule-epidermal growth factor 8,MFG-E8)最早发现于哺乳动物乳腺分泌物中[7]。人MFG-E8蛋白主要由N端表皮生长因子样结构域以及C端两个凝血因子Ⅴ/Ⅷ样结构域构成[8]。研究发现,MFG-E8在细胞凋亡、衰老、炎症反应等病理生理过程以及动脉粥样硬化、心肌梗死、肿瘤等疾病中扮演重要角色[9-13]。新近研究表明,相较于小鼠正常颈动脉,钙化颈动脉中MFG-E8表达显著上调;MFG-E8可显著促进血管平滑肌细胞成骨样分化;小鼠MFG-E8基因缺失可显著抑制氯化钙诱导的颈总动脉钙化[14]。微小RNA(microRNA,miRNA)是能与信使RNA(messenger RNA,mRNA)3′端非翻译区结合并抑制mRNA翻译的一类非编码RNA[15]。近年来,miRNA被认为是细胞功能的新型调节因子,miRNA诊断及治疗策略正迅速成为全新观念[16]。
细胞凋亡、衰老、炎症反应均被证实与CAVD的发生发展密切相关,结合近期研究发现,我们提出科学假说:MFG-E8在CAVD病程中发挥重要作用。本研究旨在探究MFG-E8是否参与调控AVICs成骨样分化,并寻找影响MFG-E8表达的miRNA,为CAVD治疗提供新思路和新靶点。
1.1 人主动脉瓣标本获取
本研究符合《赫尔辛基宣言》,标本获取由华中科技大学同济医学院伦理委员会批准。钙化主动脉瓣取自因严重CAVD行主动脉瓣置换手术患者,术前心脏超声检查示主动脉瓣明显增厚、回声增强、瓣叶上可见广泛分布的钙化强回声,主动脉瓣中重度至重度狭窄,流速显著增快;术中剪下主动脉瓣,肉眼观察发现瓣膜增厚、变黄、有明显钙化斑,触摸发现其质地僵硬。排除风湿性瓣膜病、主动脉瓣二叶式畸形、感染性心内膜炎患者。正常非钙化主动脉瓣瓣膜取自因扩张型心肌病行心脏移植手术患者,术前心脏彩超检查示主动脉瓣无明显增厚、瓣叶上无强回声,开放及闭合正常;术中剪下主动脉瓣,肉眼观察瓣膜呈菲薄半透明状,触摸发现其质地软。根据实验目的不同,予以相应处理:需进行免疫组织化学染色的标本置于4%多聚甲醛中固定;需提取组织蛋白质或RNA的主动脉瓣,冲洗去除血液并吸干水分后,置于液氮冻存;需提取AVICs的主动脉瓣在离体后,置于DMEM高糖培养液(Gibco公司)中,带回实验室处理。
1.2 免疫组织化学染色
瓣膜固定48 h后,进行石蜡包埋及切片,切片厚度为5 μm。切片依次浸泡二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化,柠檬酸抗原修复液进行抗原修复,3%双氧水溶液避光孵育阻断内源性过氧化物酶,5%山羊血清室温封闭30 min。随后,滴加一抗,4℃孵育过夜,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后,滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗,室温孵育50 min。PBS洗涤后,滴加二氨基联苯胺显色液,显微镜下观察组织出现棕黄色着色后,自来水冲洗,苏木精染色3 min,自来水冲洗,返蓝液返蓝。最后切片进行脱水透明,中性树脂封片,显微镜拍照。实验所用抗体信息见表1。
表1 免疫组织化学染色所用抗体信息Table 1 Antibodies for immunohistochemical staining
1.3 组织蛋白质及RNA提取
瓣膜从液氮中取出后置于陶瓷研钵中,重复多次加入液氮冷冻组织,用研磨杵将组织研磨成粉末状。需提取蛋白质的组织中加入混有蛋白酶/磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液,超声裂解后,12000 r/min 4℃离心15 min,取上清。BCA试剂盒(碧云天公司)测得蛋白浓度后,加入上样缓冲液并混匀,95 ℃加热器加热10 min,随后置于冰上或冻于-20℃冰箱保存。需提取RNA的组织,采用RNA提取试剂盒(诺唯赞公司)提取大分子RNA及miRNA,分别采用HiScript Ⅲ RT SuperMix(诺唯赞公司),miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit(诺唯赞公司)逆转录为cDNA后,于-20 ℃冰箱冰冻保存。
1.4 细胞分离、培养及干预
将瓣膜组织置于含有1%双抗的无菌PBS中,移液器吹打洗涤后,转移至含有2 mg/mL Ⅰ型胶原酶(biosharp公司)的DMEM高糖消化液中。于37 ℃培养箱中消化30 min后,用移液器吹打瓣膜表面以去除内皮细胞,离心,弃上清,随后加入新的消化液,37 ℃培养箱中消化12～18 h。待瓣膜完全消化后离心、弃上清,用含有10%胎牛血清(Gibco公司)的DMEM高糖培养液重悬细胞,转移至T25培养瓶中培养,每2天换1次培养液,待细胞长满后传代,采用3～5代AVICs进行细胞实验。将AVICs接种于6孔板干预后进行Western blot实验,接种于12孔板进行钙盐沉积实验。细胞接种后,待融合度达到70%～80%进行转染实验,取4支1.5 mL EP管,各加入250 μL opti-MEM溶液(Gibco公司),其中两支加入10 μL Lipo 3000(ThermoFisher公司),另外两支分别加入10 μL浓度为20 mmol/L的对照组和实验组siRNA或miRNA(购自锐博生物科技公司,序列信息见表2),分别混匀后,再将两支lipo 3000管与RNA管混合,静置15 min,6孔板中每孔加入250 μL溶液,12孔板每孔125 μL,并用opti-MEM分别补齐至2 mL和1 mL。转染8 h后换液,对照组换为含有2%胎牛血清DMEM高糖培养液,实验组换为成骨培养液(osteogenic medium,OM),3 d后,收取6孔板中细胞蛋白质进行后续实验。12孔板每2天换1次培养液,21 d后进行茜素红染色。OM培养液为含有2%胎牛血清,10 mmol/L β-甘油磷酸,100 nmol/L地塞米松,50 mg/mL维生素C的DMEM高糖培养液。
表2 siRNA及miRNA序列信息Table 2 Information of siRNA and miRNA sequences
1.5 免疫荧光染色
细胞接种至共聚焦皿,培养至汇合度达50 %后,弃去培养液,PBS洗3遍,加入4%多聚甲醛室温固定15 min,弃去多聚甲醛,PBS洗3遍;滴加0.2% Triton X-100室温孵育10 min进行破膜,弃去破膜液,PBS洗3遍;滴加10 %山羊血清37℃温箱中封闭30 min,滴加一抗4 ℃孵育过夜;弃去一抗,PBS洗涤10 min,重复3次,滴加二抗,室温避光条件下孵育30 min;弃去二抗,PBS洗涤10 min,重复3次,滴加1滴含DAPI封片液,共聚焦显微镜拍照。滴加二抗后所有操作均在避光条件下进行。实验所用抗体信息见表3。
表3 免疫荧光染色所用抗体信息Table 3 Antibodies for immunofluorescence staining
1.6 Western blot实验
将相同蛋白质量的样品加入SurePAGETM预制聚丙烯酰胺凝胶(金斯瑞公司)进行分离,分离后利用eBlot L1快速湿转系统将蛋白转印至0.22 μm的PVDF膜上,将膜放置在含5%脱脂牛奶的TBS-T溶液中室温孵育1 h,然后与一抗在4 °C摇床上孵育过夜。最后,与适当的HRP偶联的二抗和ECL显影液分别孵育后,通过化学发光系统来检测特异性结合。为计算相对表达量,使用Image J软件对条带进行分析。实验所用抗体信息见表4。
表4 Western blot实验所用抗体信息Table 4 Antibodies for Western blotting
1.7 茜素红染色
瓣膜组织石蜡切片脱蜡后,向切片上组织滴加茜素红染液至完全覆盖,5～10 min后自来水清洗切片,65 ℃烤箱中,烘烤4 h。随后,将切片浸泡至二甲苯中5～10 min进行透明处理,中性树胶封片,显微镜下拍照分析。12孔板中的细胞干预21 d后,PBS洗涤细胞3次,4%多聚甲醛溶液固定15 min,随后蒸馏水洗涤3次,0.2%茜素红溶液孵育30 min,用蒸馏水洗涤去除多余的染料,最后用相机及显微镜进行拍照,Image-Pro Plus软件分析茜素红阳性染色区域百分比。
1.8 实时荧光定量PCR(real-time PCR)实验
用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix和miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix(诺唯赞公司)以及特异性引物,在StepOne Plus PCR仪上对制备好的cDNA进行扩增,并分析熔解曲线。实验所用引物:RUNX2正向引物5′-CTGTCATGGCGGGTAACGAT-3′,反向引物为5′-GG-GTTCCCGAGGTCCATCTA-3′;MFG-E8正向引物为5′-GCCCTGGATATCTGTTCCAAA-3′,反向引物为5′-GCGATCTGTGAGTTGGCAAT-3′;GAPDH正向引物为5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′,反向引物为5′-GGGGT-CGTTGATGGCAACA-3′;hsa-miR-214-5p正向引物为5′-CGCGTGCCTGTCTACACTTG-3′,反向引物为5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′;U6正向引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。
1.9 统计学方法
采用GraphPad Prism 8进行统计分析,所有计量资料以均值±标准差表示。两组数据符合正态分布且通过方差齐性检验,采用t检验;两组数据符合正态分布但未通过方差齐性检验,则采用Welch校正t检验;两组数据中任意一组不符合正态分布,则采用Mann-Whitney秩和检验。P值小于0.05被认为差异具有统计学意义。
2.1 人钙化主动脉瓣中MFG-E8表达显著升高
瓣膜组织切片茜素红染色结果显示,钙化瓣膜中有大量钙盐沉积;免疫组织化学染色发现,与非钙化瓣膜相比,钙化瓣膜中MFG-E8表达明显增多(图1A)。
Western blot实验对瓣膜组织中MFG-E8及成骨样分化指标RUNX家族转录因子2(RUNX family transcription factor 2,RUNX2)蛋白水平进行相对定量,结果显示钙化瓣膜中MFG-E8及RUNX2表达显著上调(图1B、1C)。
A:组织切片茜素红及免疫组织化学染色代表性图片,标尺=50 μm;B:Western blot检测RUNX2及MFG-E8表达水平代表性图片;C:RUNX2及MFG-E8相对表达量统计分析,*P<0.05图1 人钙化主动脉瓣中MFG-E8表达显著升高Fig.1 MFG-E8 protein expression is significantly increased in human calcified aortic valves
2.2 MFG-E8调控AVICs成骨样分化及钙盐沉积
瓣膜组织细胞提取培养后,首先通过免疫荧光染色对AVICs纯度进行检测,结果显示AVICs表达间质细胞标志波形蛋白(Vimentin),而不表达内皮细胞标志白细胞分化抗原(CD31),证明提取的AVICs中不含内皮细胞(图2A)。OM诱导AVICs成骨样分化,免疫荧光结果显示成骨样分化AVICs中MFG-E8及RUNX2表达明显上调(图2B)。随后,为探究MFG-E8是否参与调控AVICs成骨样分化,采用siRNA沉默AVICs中MFG-E8,并利用OM诱导其成骨样分化。Western blot结果显示:OM干预AVICs后,MFG-E8及成骨样分化指标RUNX2、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)表达明显升高,沉默MFG-E8可显著抑制AVICs中RUNX2及ALP表达(图2C～2F)。茜素红染色结果显示:沉默MFG-E8可显著抑制AVICs中钙盐沉积(图2G、2H)。以上实验结果表明,MFG-E8在AVICs成骨样分化及钙盐沉积过程中发挥重要作用。
A:AVICs纯度鉴定免疫荧光染色代表性图片,标尺=50 μm;B:免疫荧光检测OM干预后AVICs中MFG-E8及RUNX2表达代表性图片,标尺=50 μm;C:Western blot检测siMFG-E8/siNC及OM干预后AVICs中ALP、RUNX2及MFG-E8表达的代表性图片;D～F:ALP、RUNX2及MFG-E8相对表达量统计分析;G:茜素红染色肉眼及镜下代表性图片,标尺=50 μm;H:茜素红染色阳性百分比统计分析;CTR:2% FBS DMEM高糖培养液对照组;OM:成骨培养液组;siNC:无义序列siRNA作为对照;siMFG-E8:靶向MFG-E8的siRNA;*P<0.05,**P<0.01图2 MFG-E8调控AVICs成骨样分化及钙盐沉积Fig.2 MFG-E8 regulates osteoblastic differentiation of AVICs and calcium deposition
2.3 miR-214-5p抑制AVICs中MFG-E8表达
TargetScanHuman网站预测发现miR-22-3p及miR-214-5p是两个可能靶向MFG-E8的保守miRNA。在AVICs中转染miR-22-3p或miR-214-5p模拟物(mimics)后Western blot检测结果显示:miR-214-5p可抑制MFG-E8表达,miR-22-3p对MFG-E8表达量无影响。以上研究表明,miR-214-5p可能是一种调控MFG-E8表达的miRNA(图3)。
A:Western blot检测miR-22-3p mimics对AVICs中MFG-E8表达影响的代表性图片;B:MFG-E8相对表达量统计分析;C:Western blot检测miR-214-5p mimics对AVICs中MFG-E8表达影响的代表性图片;D:MFG-E8相对表达量统计分析,**P<0.01; miR-NC:无义序列miRNA作为对照图3 miR-22-3p和miR-214-5p对MFG-E8表达的影响Fig.3 Effects of miR-22-3p and miR-214-5p on the expression of MFG-E8
2.4 miR-214-5p调控AVICs成骨样分化及钙盐沉积
在AVICs中转染miR-214-5p mimics,并采用OM培养液诱导AVICs成骨样分化,Western blot实验结果显示,MFG-E8及成骨样分化指标ALP、RUNX2的表达被显著抑制(图4A～4D);茜素红染色结果表明,转染miR-214-5p mimics可显著抑制AVICs中钙盐沉积(图4E、4F)。以上结果表明,miR-214-5p在AVICs成骨样分化及钙盐沉积过程中发挥重要调控作用。
A:Western blot检测miR-NC/miR-214-5p mimic及OM干预后AVICs中ALP、RUNX2及MFG-E8表达的代表性图片;B～C:ALP、RUNX2及MFG-E8相对表达量统计图;D:茜素红染色肉眼及镜下代表性图片,标尺=50 μm;E:茜素红染色阳性百分比统计;CTR:2% FBS DMEM高糖培养液对照,OM:成骨培养液,miR-NC:无义序列miRNA作为对照;*P<0.05,**P<0.01图4 miR-214-5p调控AVICs成骨样分化及钙盐沉积Fig.4 miR-214-5p regulates osteoblastic differentiation of AVICs and calcium deposition
2.5 人钙化瓣膜中miR-214-5p表达明显下调
为探究人钙化瓣膜及非钙化瓣膜中miR-214-5p的表达是否存在差异,进行了real-time PCR实验。结果显示,钙化瓣膜中RUNX2及MFG-E8的mRNA水平显著上调,而miR-214-5p的表达明显下调(图5)。
全球心血管疾病负担报告指出,CAVD患病及死亡人数在过去30年间逐年攀升,已成为严重的全球性疾病负担[17]。主动脉瓣钙化是CAVD核心病理过程,引起瓣膜僵硬狭窄,从而导致血流动力改变。研究表明主动脉瓣钙化是多种细胞类型参与的主动复杂过程,包括内皮细胞、间质细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等,目前认为间质细胞成骨样分化是主动脉瓣钙化核心环节,但其机制尚不明确[1]。
real-time PCR检测人钙化及非钙化瓣膜中RUNX2(A)和MFG-E8(B)的mRNA及miR-214-5p(C)相对表达量;**P<0.01图5 人钙化瓣膜中miR-214-5p表达明显下调Fig.5 miR-214-5p expression is significantly reduced in human calcified aortic valves
本研究发现,CAVD患者的钙化主动脉瓣中MFG-E8表达显著升高;分离人主动脉瓣膜间质细胞体外诱导其成骨样分化,同样观察到显著上调的MFG-E8;siRNA沉默AVICs中MFG-E8表达再进行成骨样分化诱导,结果发现成骨样分化指标ALP及RUNX2显著下调,且钙盐沉积明显减少,表明下调MFG-E8表达可显著抑制AVICs成骨样分化。本研究证实MFG-E8是AVICs成骨样分化的重要调节因子,在CAVD中可能发挥重要作用。有研究表明,在血管平滑肌细胞成骨样分化过程中,MFG-E8表达显著上调,抑制MFG-E8表达可明显降低RUNX2及骨形态发生蛋白2(BMP2)表达,阻止血管平滑肌细胞成骨样分化[14]。小鼠中MFG-E8基因缺失可以显著减轻氯化钙诱导的颈总动脉血管钙化。另外,有研究对鸟类蛋壳进行定量蛋白质组学检测发现,MFG-E8可引导含有无定形碳酸钙的囊泡到达需矿化部位,从而发生钙化,形成蛋壳[18]。这些研究均表明MFG-E8是生物钙化的重要调节因子,在细胞成骨样分化及钙盐沉积中发挥重要作用。
本研究对可能调控MFG-E8表达的miRNA进行探索,发现miR-214-5p可调节MFG-E8表达,并参与AVICs成骨样分化及钙盐沉积。本研究发现,人钙化主动脉瓣膜中miR-214-5p水平显著下调,提示外源性补充miR-214-5p可能成为阻止AVICs成骨样分化及钙盐沉积,抑制CAVD病程进展的新策略。以往研究发现,CAVD患者钙化瓣膜中miR-214-3p表达显著下调,在AVICs中过表达miR-214可显著降低骨桥蛋白、转录因子Sp7、转录激活因子4(ATF4)以及RUNX2等成骨分化指标表达,从而抑制AVICs成骨样分化[19]。荧光素酶报告实验表明,miR-214可结合Sp7和ATF4的mRNA并抑制其翻译,从而降低Sp7及ATF4表达。以高脂饮食及维生素D腹腔注射诱导主动脉瓣钙化模型,miR-214敲除大鼠主动脉瓣跨瓣压差及钙化程度显著高于对照组,表明miR-214表达降低显著加重了主动脉瓣钙化。材料学研究发现,将负载miR-214抑制剂的聚乙烯亚胺(PEI)功能化氧化石墨烯(GO)复合物组装至丝素蛋白/羟基磷灰石(SF/HAP)支架,可通过控制miR-214抑制剂释放,激活成骨分化关键因子ATF4,促进小鼠成骨细胞成骨样分化[20]。但也有研究与上述结果不一致,例如有研究表明,CAVD患者相较于主动脉瓣关闭不全患者,其主动脉瓣组织中miR-214表达显著上调;诱导AVICs中miR-214表达上调,可激活NF-κB炎症信号通路,IL-6、IL-8及MCP-1等炎症因子增多,成骨分化指标RUNX2及BMP2等表达上调,促进AVICs成骨样分化[21]。另一项研究发现,钙化主动脉瓣中巨噬细胞向M1型极化,释放含有miR-214的微小囊泡,miR-214可抑制AVICs中TWIST1蛋白表达,从而导致AVICs成骨样分化。此外,在高脂喂养ApoE敲除小鼠诱导主动脉瓣钙化的模型中,尾静脉注射miR-214抑制物,发现小鼠主动脉瓣钙化程度显著减轻[22]。还有研究发现负载miR-214水凝胶可通过释放miR-214干预AVICs,引起AVICs中ALP活性升高,促进AVICs成骨样分化[23]。分析上述研究结果和结论的差异,可能有以下几点原因:①组织中miR-214表达存在争议可能是由于对照组选择不同,主动脉瓣关闭不全患者瓣膜和扩张型心肌病患者瓣膜的miR-214表达基础值可能存在差异,这些瓣膜虽并无钙化,但并不能完全视作正常瓣膜;②一些实验中只检测了一种成骨样分化指标,因此可能导致实验结果发生偏倚;③动物实验采用实验物种不同,由于不同动物的miR-214序列和靶标不尽相同,从而导致实验结果不同。本研究以miR-214-5p为研究对象,排除了miR-214-3p干扰,通过检测钙盐沉积以及成骨分化指标RUNX2和ALP,多重角度证实了miR-214-5p对AVICs成骨分化的影响。
本研究仍存在一些不足之处,如未进行荧光素酶报告实验直接证明miR-214-5p与MFG-E8 mRNA的结合,未进行动物实验在体内证实miR-214-5p及MFG-E8对主动脉瓣钙化的影响,在后续实验中将进一步深入研究。
猜你喜欢茜素主动脉瓣成骨茜素红“开关式”荧光探针测定水中微量铜河北大学学报（自然科学版）(2022年2期)2022-04-22经典Wnt信号通路与牙周膜干细胞成骨分化口腔医学(2021年10期)2021-12-02醌茜素抑制PI3K通路的磷酸化对宫颈癌CaSki细胞凋亡和自噬的影响安徽医科大学学报(2020年12期)2021-01-1822例先天性心脏病术后主动脉瓣下狭窄的再次手术心肺血管病杂志(2020年5期)2021-01-14超高龄主动脉瓣狭窄患者行经导管主动脉瓣置换术围术期护理分析中华养生保健(2020年5期)2020-11-16主动脉瓣环扩大联合环上型生物瓣膜替换治疗老年小瓣环主动脉瓣狭窄的近中期结果心肺血管病杂志(2019年4期)2019-06-27糖尿病大鼠Nfic与成骨相关基因表达的研究中华老年口腔医学杂志(2016年2期)2017-01-15芬顿法氧化降解水中茜素红的研究*广州化工(2016年8期)2016-09-02液晶/聚氨酯复合基底影响rBMSCs成骨分化的研究中国病理生理杂志(2015年8期)2015-12-2130例Ⅰ型成骨不全患者股骨干骨折术后康复护理天津护理(2015年4期)2015-11-10