文冠果根腐病主要生物学特性及室内药剂筛选

张国新,宋单波,刘保军,王 权,白剑宇,郭庆元

(1.**农业大学农学院,乌鲁木齐 830052;2.**林科院经济林研究所/**林果树种选育与栽培重点实验室,乌鲁木齐 830063)

【研究意义】文冠果是我国北方独有的木本油料植物[1],其种子含油率约30%,种仁含油率约60%[2-4]。文冠果具有耐旱、耐瘠薄、耐盐碱、抗风固沙、抗低温等优良生态学特点,是水土保障、防风固沙和防治土地荒漠化的优良树种[5-8],兼具极高观赏性[9]。文冠果作为木本油料树种和园林绿化观赏树种在我国北方多地种植,其中内蒙古、山西、陕西、河北、山东、**等省(自治区)均有较大的种植面积[10-11]。2019年6月文冠果根腐病在**阿克苏地区沙雅县、昌吉州木垒县发生,造成近20%文冠果苗木枯萎。文冠果根腐病是一种多病原菌复合侵染发生的一种土传病害,其中瓜果腐霉菌(Pythiumaphanidermatum)的分离频率最高,达73%的分离率,瓜果腐霉菌的侵染是造成文冠果根腐病发生的主导因素。文冠果(Xanthocerassorbifoiium),属无患子目(Sapindales),无患子科(Sapindaceae),别名文官果、木瓜、崖木瓜等[12]。文冠果的根系为肉质根,在常规移栽中常常造成大量的根系损伤,增加了病原菌自伤口侵染的机会,加之灌水后苗木下沉,改变了根茎原有的环境条件,在高湿高温不透气的环境条件下,皮层很快引起水肿样腐烂,导致地上部分和根系通道被切断使营养无法运输到根系,造成死亡。研究该病原菌的主要生物学特性,分析该病原菌的主要生物学特性,筛选抑菌效果明显的防控药剂,对后续田间药剂防控提供备选农药有实际意义。【前人研究进展】根腐病通常是由多种病原复合侵染引起的一种作物根部病害,其常见的病原菌包括腐霉菌、镰刀菌、丝核菌等多种病原菌[13]。其中腐霉菌和镰刀菌不同种是引起作物根腐病的主要病原菌,在这些病原菌的鉴定中已逐步建立了成熟的鉴定技术,包括病原菌的形态学鉴定、致病性实验验证和通过分子生物学鉴定技术,确保了病原菌鉴定的准确度。【本研究切入点】根腐病是危害文冠果根部的一种主要病害,目前国内外对文冠果根腐病的防治尚缺乏高效的防控药剂和防控技术。需通过不同碳源、温度和pH值条件,明确病原菌主要生物学特性,以及室内药剂毒力测定,筛选高效抑菌药剂。【拟解决的关键问题】研究瓜果腐霉菌病原菌生物学特性且进行室内药剂测定毒力,研究文冠果根腐病主要病原菌(瓜果腐霉菌)的生物学特性,筛选出抑菌效果明显的杀菌剂,为田间药剂筛选提供备选药剂。

1.1 材 料

1.1.1 供试菌株

供试材料分别于阿克苏地区沙雅县、昌吉州木垒县和**林科院院内文冠果种植园采集文冠果根腐病病根和根际土壤样本。供试菌株XJ-PA由**文冠果根部、土壤分离纯化获得,并经实验室准确鉴定和保存的致病菌株。

1.1.2 供试培养基配制

供试培养基:培养基种类包括PDA、PSA、OA、PCA、MA、胡萝卜培养基和玉米粉培养基(CMA)和WA等8种不同碳源培养基,依据相关文献配方配制不同碳源培养基[14]。

PDA培养基:新鲜马铃薯200 g切丁,加水煮沸致马铃薯丁松软,4层纱布过滤、琼脂粉20 g、葡萄糖20 g,加入蒸馏水补足至1 000 mL;121℃下灭菌20 min后保存备用。

PSA培养基:配制方法同PDA一致,将等量葡萄糖置换为蔗糖即可。

OA培养基:燕麦片20 g,4层纱布过滤、琼脂17 g,加水补足至1 000 mL;

麦芽糖琼脂培养基(MA):麦芽糖20 g、葡萄糖10 g、琼脂粉20 g,加入蒸馏水补足至1 000 mL;灭菌备用。

玉米粉CMA培养基:玉米粉20 g、琼脂粉20 g,加水补足至1 000 mL;

胡萝卜培养基:100 g去皮胡萝切丁,加水煮沸致胡萝卜丁松软、琼脂20 g,加入蒸馏水补足至1 000 mL;灭菌备用。

PCA培养基:去皮马铃薯20 g、去皮胡萝卜20 g,加水煮沸致马铃薯与胡萝卜松软、琼脂13 g,加蒸馏水补足至1 000 mL;灭菌备用。

WA水琼脂培养基:琼脂粉18 g,加入蒸馏水补足至1 000 mL;灭菌备用。

1.1.3 供试药剂

参考相关文献[15-17]等,筛选出12种供试药剂,药剂名称、剂型及生产厂家等。供试药剂名称、剂型及生产厂家为药剂2×109CFU/g 枯草芽孢杆菌(粉剂,山东万事达农化有限公司);50% 腐霉·福美双(福美双:40%;腐霉利:10%)(可湿性粉剂,成都科利隆有限公司);30% 噁霉灵(水剂,山东恒利达生物科技有限公司);80% 代森锰锌(可湿性粉剂,河北双吉化工有限公司);722 g/L 霜霉威盐酸盐(水剂,拜耳作物科学(中国)有限公司);30% 甲霜·噁霉灵(噁霉灵:24%;甲霜灵:6%)(水剂,中农立华(天津)农用化学品有限公司);500 g/L甲基硫菌灵(悬浮剂,江苏丰山集团股份有限公司);37% 苯醚甲环唑(水分散立剂,成都西部爱地作物科学有限公司);21% 过氧乙酸(水剂,河北海虹生化有限公司)50%氯溴异氰尿酸(粉剂,河北上瑞化有限公司);47%春雷·王铜(可湿性粉剂,江西禾益化工股份有限公司);45%戊唑·咪鲜胺(水乳剂,江苏景宏生物科技有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 生物学测定

将培养1 d菌龄的供试菌株,用5 mm灭菌打孔器打取菌落边缘附近大小均匀的菌饼,接种于各处理的供试培养基中,在25℃下恒温培养(除温度试验外)24 h后,用十字交叉法测量各处理的菌落直径,每个处理重复4次。

1.2.1.1 不同培养基对病原菌生长的影响

将供试菌株在PDA培养基上25℃培养3 d后,用灭菌后的内径为5 mm打孔器在菌落边缘打取的菌饼,并将5 mm菌饼菌丝面分别接种于PDA、PSA、OA、PCA、WA、MA、胡萝卜培养基和玉米粉培养基(CMA)。

1.2.1.2 不同温度对病原菌生长的影响

将供试菌株接种在PDA平板中央,分别置于5、10、15、20、22、25、28、30、35和40℃恒温培养。

1.2.1.3 不同pH对菌丝生长的影响

用HCl(1 mol/L)和NaOH(1 mol/L)溶液调整PDA培养基的pH值,使培养基的配制值分别为pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0。

1.2.1.4 杀菌剂对病原菌菌丝生长的影响

将菌株在PDA培养基上培养24 h,用内径为5 mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼备用。将各供试药剂分别以推荐使用浓度为参考,稀释从高到低设置8个药剂浓度梯度。将各不同浓度药剂与熔化并冷却至40℃的PDA培养基按1∶9比例(总体积10 mL)配制成含药培养基,以放入与药剂溶液等体积无菌水作为对照[18]。倒入直径9 cm的培养皿中,待培养基平板凝固后,将菌饼菌丝面朝下放置培养基中央。每个处理重复3次。25℃条件下恒温培养24 h、5 d后,采用十字交叉法[19]测量菌落直径,并计算其抑菌率。设置8个浓度中,按照抑制率保留适合的5个浓度梯度;以药剂浓度(mg/L)的对数值为自变量,抑制率的机率值为因变量,运用SPSS21.0建立毒力回归方程及相关系数R值,计算各药剂的抑菌中浓度(EC50),比较抑菌效果。

抑菌率(%)=(对照菌落净生长量-药剂处理菌落净生长量)/对照菌落净生长量×100。

2.1 不同培养基对菌丝生长的影响

研究表明,该病原菌在供试的8种培养基上均可长,CMA、PCA、OA培养基生长速率均无太大差别。生长速率从大到小依次为PDA、CMA、PCA、OA、PSA、胡萝卜培养基、WA、MA。其中在PDA上生长速率最高,菌落大而密,菌丝生长旺盛,长势最好;在MA培养基上生长最慢,菌落最小,菌丝最稀疏,且WA菌丝生长稀疏。图1

注：图中不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05),下同

2.2 不同温度对菌丝生长的影响

研究表明,病原菌菌丝在15～40℃温度范围内均可生长,15～35℃菌落直径随温度的升高而增加,其中5～10℃菌丝无法生长,35℃为最适生长温度,当温度超过35℃后菌丝生长开始受到不同程度的抑制,生长速率明显降低。病原菌的最适温度在(35±1)℃。图2

图2 不同温度条件下瓜果腐霉菌在PDA上菌落生长变化

2.3 不同pH对菌丝生长的影响

研究表明,该病原菌在pH值为3时菌丝不生长,在pH值为4～11均能生长,pH值在6～8范围内较适合菌丝生长,最适pH值为8。当pH大于8时,菌丝的生长因pH的增加而逐渐降低。病菌在pH为8时生长最为良好。图3

图3 不同pH条件下瓜果腐霉菌菌落生长变化

2.4 不同杀菌剂对病原菌的抑菌效果

研究表明,12种药剂对该病原菌的毒力大小存在较大差异,其中30%甲霜·噁霉灵毒力最大,EC50值为1.259 9 mg/L,其次为50%腐霉·福美双,EC50值为8.156 4 mg/L;2×109CFU/g枯草芽孢杆菌毒力最小,EC50值为4 107.327 mg/L。其余9种药剂的毒力从小到大依序为37%苯醚甲环唑、500 g/L甲基硫菌灵、21%过氧乙酸、47%春雷·王铜、50%氯溴异氰尿酸、30%噁霉灵、45%戊唑·咪鲜胺、722 g/L霜霉威盐酸盐、80%代森锰锌。表1

表1 12种杀菌剂下文冠果根腐病病菌毒力变化

续表1 12种杀菌剂对文冠果根腐病病菌毒力测定结果

瓜果腐霉除导致果蔬采摘后腐烂外,还可引起大豆根腐病[20]、小麦腐霉根腐病[21]、玉米青枯病[22]番茄根腐病[23]等多种根腐病[24]。在瓜果腐霉的生物学特性研究中,洪小雨等[25]采用菌丝生长速率法对瓜果腐霉菌导致豇豆软腐病进行了生物学特性研究,结果表明,瓜果腐霉,最适碳源培养基为可溶性淀粉培养基生长最快,温度15～40℃范围内均能生长;适宜生长温度为30～35℃,35℃时生长最快,在pH为5.0～12.0范围内均能生长,适宜pH范围为7.0～9.0,pH为9时瓜果腐霉生长最快,与试验存在一定差异。而光照对瓜果腐霉菌生长无显著差异[25]。

研究中主要针对瓜果腐霉菌进行了生物学特性研究,并筛选出抑菌效果明显的杀菌剂3种,包括甲霜·噁霉灵、腐霉·福美双和80%代森锰锌,在后续的初期的室内药剂防控试验中对镰刀菌等其它病原菌也同样具有较好的防治效果。

张旭等[26]的研究中芽孢杆菌(L-NM62),对瓜果腐霉有较强的抑菌效果,因此需针对该病原菌进行拮抗菌筛选研究。在该病害的生物学特性研究中,只针对不同碳源、不同温度、不同pH 3个方面进行试验,并未针对氮源和该病原菌的致死温度进行有效试验。研究均在室内进行,环境条件可控,而田间受温度、湿度、雨水等因素影响,药剂防治可能略有差别。氮源、致死温度和合理科学筛选的有效药剂进行田间药剂试验将是下一步研究工作重点。

4.1在不同碳源培养基中,最适生长培养基为PDA,最适生长温度为(35±1)℃,最适pH值为8。

4.230%甲霜·噁霉灵毒力最大,其次为50%腐霉·福美双和80%代森锰锌,筛选出的甲霜·噁霉灵、腐霉·福美双、80%代森锰锌3种抑菌效果较好的药剂可作为田间药效防治试验的备选农药。

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