吴淑嫄，华馨丽，李碧云，宣红云，邢玲燕，袁卉华*
（南通大学1 生命科学学院，2 神经再生重点实验室，南通 226019）
周围神经损伤是一种常见的创伤形式，目前主要由交通、工伤和地震等事故所引发[1]，根据世界卫生组织统计，仅在欧洲每年就有多达30 万例；
在美国，每年约有20 万名患者接受手术治疗，而我国每年周围神经损伤病例约30 万[2]。神经损伤后，由于两端收缩会产生缺口，因此需要神经桥接物来引导新生神经，从而完成神经再生[3]。目前，传统自体神经移植仍然是临床治疗神经缺损的黄金手段，但由于自体神经来源有限、组织尺寸和结构难以匹配等原因，不能被广泛地应用[4-6]。随着组织工程技术的不断发展，天然高分子生物材料如丝素蛋白、壳聚糖和透明质酸等，特别是丝素蛋白，由于其极好的生物相容性、可降解性和低免疫原性深受广大研究者的青睐[7-9]。研究[10-11]证实，丝素蛋白制备的周围神经微导管能有效促进神经的再生及损伤轴突的延伸。但与自体神经移植修复相比还有较大的差距。为了更好地促进神经吻合术后的轴突再生，常通过使用药物辅助治疗的方式来提高损伤神经的恢复效果。
弥可保作为一种甲基转移酶的辅因子，是神经系统功能必须的维生素，能够促进甲硫氨酸和胸腺嘧啶的合成、增加叶酸摄取、激活氨基酸、促进核酸与蛋白质的生物合成以及参与神经组织蛋白的形成[12-15]。弥可保还可以刺激轴突以促使神经修复甚至再生，从而改善神经纤维的损伤[15]，但是弥可保的水溶性较差，限制了其在神经缺损修复中的应用[16]。环糊精作为一类新型的药物包合材料，具有环状中空筒型、环外亲水、环内疏水的特殊结构和性质，能使不同类型的化合物通过分子间相互作用包括范德华力、疏水相互作用、静电相互作用、偶极-偶极相互作用和氢键相互作用进入它们的空腔[17]。因此，如何利用中空结构的环糊精解决弥可保的低水溶性和提高其负载率是主要问题之一。
本文拟制备具有较好的负载效率并能保持良好的释放性能和稳定性的β-环糊精包合弥可保的丝素蛋白人工神经移植物。首先，通过分子动力学计算模拟，优化β-环糊精与弥可保最优包合比；
优化实验条件，制备β-环糊精包合弥可保的丝素蛋白人工神经移植物；
研究该移植物中弥可保的缓释规律，并通过牛蛙坐骨神经缺损电生理实验来评价神经的功能恢复情况。该研究工作的开展，将构建能够稳定原位释放弥可保的人工神经移植物，提高缺损神经的修复效果，为周围神经缺损修复支架的设计提供新策略。
1.1 材料与仪器 羧甲基β-环糊精购买于山东智源生物有限公司；
家蚕丝来源于海安仙基达有限公司；
弥可保、无水氯化钙、分析乙醇、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺都来源于南通恒昌化学公司。施万细胞购买于南京生物试剂有限公司。牛蛙来自于南通大学实验动物中心。电子天平：YH-B 10002 型，瑞安市乐祺贸易有限公司；
水平振荡器：NMYC-100 水平旋转仪，泰州诺米医疗科技有限公司；
紫外分光光度计：E300 分光光度计，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；
多标记微孔板检测仪：Enspire2300，珀金埃尔默企业管理（上海）有限公司；
储存冰箱：BCC-255KFA 型，青岛海尔股份有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 β-环糊精包合弥可保的丝素蛋白人工神经移植物的构建 建立弥可保分子和β-环糊精分子结构文件，分别采用AM1、PM3、密度泛函等不同程序算法进行结构能量优化，将能量优化的结构组合，构建“环糊精药物”非包合的孤立态文件。采用Discover Studio 软件中ZDock 模块，β-环糊精作为主体分子，弥可保作为客体分子，进行分子对接打分，根据打分结果从高到低筛选β-环糊精、弥可保的结合构型，进行能量计算确定最优构型。
将50 g 新鲜蚕丝放于2 000 mL 0.5%的Na2CO3溶液中煮沸以脱去外层的丝胶，每次煮沸30 min，重复3 次，三蒸水充分洗涤，然后置于超净台内自然晾干，得到脱胶蚕丝。将脱胶后的蚕丝溶解在三元溶剂体系中（无水CaCl2∶无水C2H5OH∶三蒸水=1∶2∶8）得到黄色透明溶液，溶解温度73 ℃。溶液置于纤维素管（截留分子质量：12～14 ku）内，用三蒸水透析3 d，透析好的丝素蛋白溶液倒于培养皿浓缩至80%。将580 mg β-环糊精、58 mg 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺）和30 mg N-羟基丁二酰亚胺混合反应30 min，将反应混合液缓慢加入再生丝素蛋白溶液，搅拌2 h，4 ℃冰箱静置过夜，透析3 d，获得β-环糊精-丝素蛋白溶液。将β-环糊精-丝素蛋白溶液通过注模-冷冻成型-冷冻干燥-交联得到β-环糊精-丝素蛋白神经移植物。将弥可保和β-环糊精以适当摩尔比（1∶1、1∶2、1∶4）投料，常温下加少量水溶解，室温，180 r／min，振荡时间分别为4、8、12 h，-80 ℃冰箱过夜，然后真空冷冻干燥12 h，包合物用铝簿包裹避光室温保存，采用红外光谱和紫外-可见吸收光谱进行检测，选择弥可保与β-环糊精最佳包合比。将β-环糊精-丝素蛋白配置成15%溶液，注入导管模具中-80 ℃冷冻干燥后，形成了β-环糊精丝素蛋白导管，取β-环糊精-丝素蛋白神经移植物70 mg 放入含不同体积5 mg／mL 弥可保PBS 缓冲液（pH 7.4）棕色瓶中，180 r／min 震荡72 h。以弥可保的负载效率为指标，利用正交实验设计进行实验，考察导管的厚度、负载温度、负载时间等工艺条件对弥可保负载率的影响，从而确定β-环糊精-丝素蛋白人工神经移植物负载弥可保的最优化条件。
1.2.2 弥可保的释放规律研究 通过体外研究β-环糊精包合弥可保的丝素蛋白神经移植物中弥可保的释放规律，以确定构建的神经移植物释放弥可保的释放浓度和最长释放时间。将含弥可保的人工神经移植物在体外PBS 缓冲液中（pH=7.4）模拟释放，在不同的时间点用紫外分光光度计测定释放出来弥可保的量，得到弥可保的体外释放曲线，然后根据此曲线拟合出释放方程，从而得到弥可保的释放规律。
1.2.3 生物活性施万细胞的相容性 将该支架材料照紫外过夜灭菌后，与施万细胞共培养于24 孔板中，细胞密度为10 000 个／孔，置于37.5 ℃，含5%CO2培养箱中共同孵育，通过CCK-8 分析施万细胞的增殖情况。在支架材料与细胞共培养1、3、5 d后，用PBS 冲洗细胞3 次，每孔加入10 μL CCK-8和100 μL 细胞培养液，置于37 ℃孵育2 h；
然后将100 μL 上清液转移至96 孔板中，通过酶标仪测量450 nm 吸光度值，每组样品分别进行3 个重复实验来评估细胞的增殖情况。
1.2.4 动物实验 将β-环糊精包合弥可保的丝素蛋白人工神经移植物修复牛蛙坐骨神经缺损1 cm，同时设空白材料桥接组、缺损组作为对照，每组每个时间点6 只牛蛙，进行牛蛙术后1、2、3 d 的功能恢复研究，剥离牛蛙的坐骨神经和腓肠肌，通过电生理检测即使用MYTO 肌电图仪记录腓肠肌最大张力，探究缺损神经的恢复情况。本实验方案获南通大学实验动物伦理委员会批准（S20200314-041）。
2.1 β-环糊精包合弥可保的丝素蛋白人工神经移植物的构建及应用 图1 所示，采用具有极好的生物相容性、可降解的天然高分子纤维蛋白——丝素蛋白、弥可保和β-环糊精，制备具有较好的负载效率并能保持良好的释放性能和稳定性的β-环糊精包合弥可保的丝素蛋白人工神经移植物。首先，将β-环糊精通过酰胺反应，嫁接在丝素蛋白支链上形成β-环糊精丝素蛋白聚合物。然后，将环糊精丝素蛋白溶液灌入导管模具中，冷冻干燥，形成环糊精丝素蛋白导管。最后，将弥可保载入β-环糊精丝素蛋白导管中，研究施万细胞在导管上的增殖情况，并将其应用于牛蛙坐骨神经修复。
图1 环糊精丝素蛋白神经导管示意图
2.2 β-环糊精包合弥可保的丝素蛋白人工神经移植物的表征 为了从分子层次上进一步解释β-环糊精包合弥可保的作用机制，通过分子动力学模拟计算β-环糊精和弥可保之间的分子作用力，范德华力为-6.767 40 kcal／mol，静电力为-1 025.460 53 kcal／mol，可以看出β-环糊精与弥可保间的较强静电力主要来源于它们之间的氢键。如图2A～B 所示β-环糊精与弥可保能形成稳定的包合作用，主要是它们之间产生了许多氢键。分子动力学模拟结果证明了β-环糊精能够很好地包合弥可保，赋予了弥可保一定的物化稳定结构。如图2C～D 所示，白色为β-环糊精丝素蛋白导管，将该导管浸入弥可保溶液中，取出干燥后获得的β-环糊精包合弥可保丝素蛋白导管，其颜色为红色。图2E 所示，采用傅里叶红外光谱仪表征，丝素蛋白中在1 500 cm-1处N-H 峰值向1 650 cm-1处C=O 峰值偏移，可以看到β-环糊精的红外光谱在1 655.79 cm-1和2 156.43 cm-1附近出现了特征吸收峰，在β-环糊精-丝素蛋白中N-H 峰值出现在1 561 cm-1处，说明β-环糊精与丝素蛋白间产生酰胺官能团，形成β-环糊精-丝素蛋白聚合物。
图2 β-环糊精包合弥可保的分子动力学模拟及导管的红外光谱表征
将弥可保和β-环糊精以适当摩尔比1∶1、2∶1 投料，常温下加少量水溶解，室温下振荡4 h，振荡速度为180 r／min。如图3 所示，采用紫外光谱法监测弥可保、β-环糊精与弥可保包合物，发现在没有β-环糊精存在下，342 nm 处显示典型的弥可保的特征峰，投入β-环糊精后，弥可保的吸光度值均上升，这说明了β-环糊精包合了弥可保，在摩尔比为1∶1时，紫外吸收值最大，说明在β-环糊精存在下，形成1∶1 包合物比较稳定。
图3 β-环糊精包合弥可保紫外吸收光谱图
2.3 β-环糊精包合弥可保的丝素蛋白人工神经移植物的缓释效应 由图4 可见β-环糊精-丝素蛋白释放弥可保初期有突释效应，造成突释的主要原因是β-环糊精-丝素蛋白载药过程中表面有弥可保吸附，初期弥可保可通过一定的浓度差快速地扩散出来形成突释；
接着较长时间的缓释是由于弥可保与β-环糊精形成包合物，起到弥可保“蓄水池”作用，因为在溶液状态下，包合作用本身是一个可逆的动力过程，不断有弥可保从包合物中释出，它们释放时长均为168 h，弥可保丝素蛋白导管累积释放弥可保质量浓度为0.192 mg／mL，而β-环糊精包合弥可保丝素蛋白导管累积释放弥可保质量浓度为0.177 mg／mL，因此，β-环糊精包合弥可保丝素蛋白导管增强了弥可保的缓释现象。
图4 β-环糊精包合弥可保丝素蛋白导管、弥可保丝素蛋白导管中的弥可保的释放曲线
2.4 β-环糊精包合弥可保的丝素蛋白人工神经移植物的生物相容性及神经修复评价 本实验采用施万细胞增殖实验研究该支架材料的体外生物相容性，见图5A。CCK8 结果显示各组细胞第3、5 天相比第1 天有明显的增长趋势，第5 天的实验组具有最高的细胞活力，且实验组的细胞活力相对细胞培养板来说差异无统计学意义，说明各组材料对细胞是低毒性的，具有良好的体内生物相容性。将β-环糊精包合弥可保丝素蛋白导管植入牛蛙坐骨神经，见图5B。丝素蛋白导管、弥可保丝素蛋白导管作为对照组，每组6 只牛蛙，共3 组平行试验。术后3 d，分别检测导管修复后的牛蛙坐骨缺损神经的电生理信号（张力信号）评估神经恢复情况，弥可保丝素蛋白导管最大值为4.73 g，见图6A；
而β-环糊精包合弥可保丝素蛋白导管组的腓肠肌张力随着电压的增大而增大，最大值为7.35 g，见图6B。结果证明了β-环糊精包合弥可保丝素蛋白导管修复缺损神经的效果优于弥可保丝素蛋白导管。
图5 导管的细胞相容性和修复牛蛙坐骨神经图
图6 导管修复牛蛙缺损神经的电生理图
神经组织工程利用天然或合成材料作为神经细胞生长的植入神经导管或支架，在过去的研究中，丝素蛋白作为一种极具可塑性和生物相容性的材料，在周围神经再生方面发挥了重要作用[18]，然而与自体神经移植修复相比还有较大的差距。目前弥可保药物被发现可用于辅助治疗神经缺损，主要是弥可保胶囊、弥可保片剂和弥可保注射剂，通过口服或注射的方式来实现神经缺损修复，但存在药效差、易感染、刺激性大等缺点[19]。针对上述问题，Y.M.YANG等[10]将弥可保溶于再生丝素蛋白溶液并灌入丝素蛋白纤维，固化交联后得到含弥可保的丝素蛋白纤维支架，实现了弥可保的体外释放，但弥可保的水溶性降低了负载率从而制约其在神经缺损修复中的应用。S.BORANDEH 等[20]为了增强氧化石墨的稳定性、载药能力和生物相容性，将β-环糊精嫁接到氧化石墨烯上，实现阿霉素pH 可控释放。冯俊峰等[21]利用聚合物聚乙二醇／聚N-异丙基丙烯酰胺的亲水性，与环糊精形成主客体包合作用，并在水中自组装形成空心胶束，赋予材料优秀力学性能的同时，在水下主客体形成的空心微球为包裹亲水性药物（神经生长因子）提供了便利。其中弥可保的水溶性和负载率成为至关重要的因素，本研究制备了具有良好的生物相容性、可降解的β-环糊精包合弥可保的丝素蛋白人工神经移植物。并基于计算机设计判断包合位点，确定最佳的反应比为1∶1；
研究体外及牛蛙体内弥可保的释放规律，发现β-环糊精包合弥可保丝素蛋白导管先因物理吸附快速释放弥可保，然后由于环糊精分子独特的外亲水，内疏水的中空结构形成的包合作用[22]，缓慢释放弥可保，释放速率低于丝素蛋白导管，它们释放时长均为168 h，弥可保丝素蛋白导管释放弥可保累积缓释后质量浓度为0.192 mg／mL，而β-环糊精包合弥可保丝素蛋白导管释放弥可保质量浓度为0.177 mg／mL。
施万细胞作为外周神经系统胶质细胞，在维持神经结构和功能中发挥着至关重要的作用[23]。通过CCK8 实验发现β-环糊精包合弥可保丝素蛋白导管能促进施万细胞的增殖，表明该材料具有很好的体外生物相容性，能作为医用材料被应用于生物医学工程领域。将导管移植入牛蛙坐骨神经缺损模型，经过3 d 的修复，β-环糊精包合弥可保丝素蛋白导管组腓肠肌的最大张力值更大，说明其更有利于牛蛙缺损神经的修复，一定程度上能恢复神经的次级感觉功能，因为腓肠肌的最大张力可以反映神经的支配能力[24]。这可能是由于β-环糊精包合了弥可保，保护弥可保的物化稳定性的同时也延缓了弥可保的释放，最大限度发挥弥可保的药效，从而有利于缺损神经的修复。综上所述，该研究工作的开展，将构建能够稳定原位释放弥可保的人工神经移植物，提高缺损神经的修复效果，为开发功能性人工神经支架提供重要策略。
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