重楼皂苷Ⅰ对去势抵抗性前列腺癌DU145细胞增殖及凋亡的影响

邹佩良 邹嘉茹 蔡家丽 何启雄 周建甫 向松涛

前列腺癌(prostate cancer, PCa)是全球常见恶性肿瘤之一,在男性中的发病率仅次于肺癌[1]。多数晚期PCa患者经雄激素剥夺治疗(androgen deprivation therapy, ADT)1～2年后便会产生耐受并逐渐演变为去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer, CRPC)[2]。近年来,研究发现多种中药单体具有良好的抗肿瘤作用,其中,重楼皂苷Ⅰ(polyphyllin Ⅰ, PPⅠ)为重楼中最主要的活性成分,可通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞周期阻滞、促进肿瘤细胞的凋亡和自噬以及抑制肿瘤细胞转移、提高化疗敏感性和调节肿瘤免疫微环境等途径发挥其抗肿瘤作用[3-4],但其对CRPC的作用及机制研究尚少。因此,本文在已有研究的基础上[5],继续探讨PPⅠ对CRPC DU145细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制。

一、试剂来源及细胞培养

PPⅠ购自成都曼彻斯特公司;胎牛血清、DMEM培养液、胰酶和磷酸盐缓冲液均购自美国Gibco公司;MTT粉和DMSO均购自广州威佳科技有限公司;细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒和蛋白上样缓冲液均购自碧云天生物公司;一抗p-ERK1/2、ERK1/2、特异性蛋白1(specificity protein 1, SP1)、Zeste基因增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2, EZH2)及羊抗兔二抗均购自CST公司;SP1、EZH2过表达质粒(pcMV6-SP1、pcMV6-EZH2)和EZH2启动子质粒(p-EZX-PG04-EZH2)均由广东省中医院韩守威教授团队提供。人CRPC DU145细胞株由中山大学孙逸仙纪念医院科研实验中心提供。将细胞株培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液,培养条件为5% CO2、37 ℃的恒温培养箱。

二、MTT检测细胞存活率

取对数生长期细胞,以3×103/孔的细胞密度接种于96孔板,待细胞贴壁后,加入不同浓度的PPⅠ(0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 μmol·L-1)溶液100 μl,分别培养24、48、72 h后,每孔加入浓度0.5 g·L-1的MTT溶液110 μl,继续培养4 h后,每孔加入DMSO 150 μl,在570 nm波长处测定每孔吸光值(A值),设空白组细胞存活率为100%,细胞存活率(%)=(加药组A值/空白组A值)×100%。

三、流式细胞仪检测细胞凋亡率

取对数生长期细胞,以3×105/孔的细胞密度接种于6孔板,待细胞贴壁后加入不同浓度的PPⅠ(0、0.4、0.8、1.2 μmol·L-1)溶液2 ml,培养24 h后使用胰酶(不含EDTA)收集细胞,将5×Binding Buffer使用去离子水稀释成1×Binding Buffer后重悬细胞,每管加入Annexin V-FITC 5 μl和PI 10 μl,避光孵育5 min,采用流式细胞仪检测样品凋亡情况,实验重复3次。

四、Western blot检测细胞中蛋白表达

取对数生长期细胞,以3×105/孔的细胞密度接种于6孔板,待细胞贴壁后裂解并刮下细胞,离心后去掉其他细胞成分,使用微量核酸蛋白定量仪测定各蛋白样品的浓度及纯度;加入蛋白上样缓冲液后振荡离心,取蛋白样品于10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离之后再进行转膜、封闭,在4 ℃条件下与一抗孵育过夜;二抗室温孵育1 h,采用化学发光法检测蛋白表达,并进行灰度值分析。

五、转染过表达质粒检测蛋白间关系

取2个4 ml EP 管,1管加入Opti-MEM 125 μl、Lipofectamine 3000 5 μl,另外1管加入Opti-MEM 125 μl、P 3000 5 μl,SP1和EZH2过表达质粒2 μg,然后将两管液体轻轻混匀后于室温静置5 min,加入转染孔中对DU145细胞进行瞬时转染24 h,再使用PPⅠ作用于DU145细胞24 h后,提取蛋白行Western blot检测。

六、双荧光素酶报告基因检测EZH2启动子活性

取对数生长期细胞,以5×104/孔细胞密度及500 μl培养液/孔体积接种于24孔板,待细胞贴壁后,每孔配制化学转染试剂Opti-MEM 50 μl、Lipofectamine 3000 1 μl 、 P 3000 1 μl和EZH2启动子质粒(p-EZX-PG04-EZH2)0.5 μg的混合液,静置5 min后加入孔中,转染24 h后进行分组处理,每孔吸出100 μl上清到对应离心管(每个样品备2个),取其中1份含上清离心管置于65 ℃水浴锅中15 min,另外1份含上清离心管则置于室温;将未水浴和水浴后的上清样品各取出10 μl移入底部不透光的96 孔板中,按双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书配制试剂并对应加入样品后振板5 s,使用荧光酶标仪检测、收集数据并计算未水浴样品与水浴样品的荧光强度值。

七、统计学方法

一、PPⅠ对DU145细胞存活率的影响

与空白组相比,随着给药浓度和时间的延长,DU145细胞存活率逐渐下降,并呈剂量和时间依赖性,表明PPⅠ能抑制DU145细胞的增殖(图1)。

图1 不同浓度PPⅠ对DU145细胞存活率的影响

二、PPⅠ对DU145细胞凋亡的影响

与空白组相比,随着给药浓度的增加,DU145细胞的早期凋亡率逐渐增加,表明PPⅠ以剂量依赖性诱导DU145细胞凋亡(图2)。

A:4组细胞的早期凋亡散点图(各组右下象限所示为早期凋亡细胞);B:4组细胞的早期凋亡率(与空白组相比,*P<0.05,**P<0.01)图2 流式细胞仪检测不同浓度PPⅠ对DU145细胞早期凋亡的影响

三、PPⅠ对p-ERK1/2与ERK1/2蛋白表达的影响

使用0.8 μmol·L-1PPⅠ作用于DU145细胞,采用Western blot检测第0、0.5、2、4、8、24 h时p-ERK1/2与ERK1/2蛋白的表达。随着时间的推移,PPⅠ逐渐增加p-ERK1/2和ERK1/2蛋白的表达,与0 h时相比,p-ERK1/2和ERK1/2蛋白的表达在2 h开始有明显差异,差异有统计学意义(P<0.05),见图3。

图3 DU145细胞p-ERK1/2、ERK1/2蛋白表达电泳图

四、PPⅠ对SP1、EZH2蛋白表达的影响

使用不同浓度的PPⅠ(0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 μmol·L-1)作用于DU145细胞24 h后,随着给药浓度的增加,SP1与EZH2蛋白的表达逐渐降低,与空白组比较,SP1与EZH2蛋白的表达均从1.2 μmol·L-1开始明显降低(P<0.05),见图4。

图4 DU145细胞SP1、EZH2蛋白表达电泳图

五、抑制ERK1/2后PPⅠ对SP1表达的影响

使用ERK1/2抑制剂(PD98059)作用于DU145细胞2 h,再加入0.8 μmol·L-1PPⅠ处理24 h后检测SP1的表达。与空白组相比,PPⅠ组SP1表达降低(P<0.05);与PPⅠ组相比,ERK1/2抑制剂+PP Ⅰ组SP1表达增加(P<0.05),见图5。

六、SP1过表达对EZH2蛋白表达的影响

PPⅠ(0.8 μmol·L-1)组及PPⅠ+空白质粒组EZH2蛋白的表达较空白组及空白质粒组偏少,而PPⅠ+SP1过表达质粒组 EZH2蛋白的表达较PPⅠ组及PPⅠ+空白质粒组相比偏高(P<0.05),见图6。

A:予ERK1/2抑制剂后SP1表达电泳图;B:抑制ERK1/2后PPⅠ对SP1表达的影响与空白组比较,*P<0.05;与PPⅠ组比较,**P<0.05)图5 Western blot检测抑制ERK1/2后PPⅠ对SP1表达的影响

A:予SP1过表达质粒后EZH2蛋白表达电泳图;B:SP1过表达对EZH2蛋白表达的影响与空白组比较,*P<0.05;与PPⅠ组比较,**P<0.05)图6 Western blot检测SP1过表达对EZH2蛋白表达的影响

七、EZH2过表达对SP1表达的影响

与SP1过表达检测EZH2蛋白表达实验结果相反,EZH2过表达不能逆转PPⅠ对SP1表达的下调作用,PPⅠ+EZH2过表达质粒组与PPⅠ组相比,SP1的表达无明显差异(P>0.05),见图7。

A:予EZH2过表达质粒后SP1表达电泳图;B: EZH2过表达对SP1表达的影响与空白组比较,*P<0.05)图7 Western blot检测EZH2过表达后对SP1表达的影响

八、予PPⅠ及SP1过表达检测EZH2启动子活性

PPⅠ组(0.8 μmol·L-1)EZH2启动子活性与空白组及空白质粒组相比偏低,PPⅠ+SP1过表达质粒组的EZH2启动子活性与PPⅠ组及PPⅠ+空白质粒组相比偏高(P<0.05),见图8。

A:予SP1过表达质粒后SP1表达电泳图;B:PPⅠ和SP1过表达对EZH2启动子活性的影响与空白组比较,*P<0.05;与PPⅠ组比较,**P<0.05)图8 Western blot检测PPⅠ和SP1过表达对EZH2启动子活性的影响

PPⅠ已被证实具有良好的抗肿瘤活性,可通过多种抗癌机制对多种肿瘤细胞发挥抑制作用[6-8]。对于形成机制复杂且预后较差的CRPC,PPⅠ或许能成为治疗CRPC或逆转CPRC细胞从激素依赖到非依赖的新型靶向药物。

本研究以人CRPC DU145细胞为研究对象,发现PPⅠ以剂量及时间依赖性方式抑制DU145细胞生长,以剂量依赖性方式诱导DU145细胞凋亡。与空白组相比,DU145细胞的存活率和早期凋亡率从PPⅠ浓度0.4 μmol·L-1开始时已产生明显差异,当PPⅠ浓度增至0.8 μmol·L-1时,DU145细胞存活率显著降低,早期凋亡率显著增加,表明少量PPⅠ即可对DU145细胞产生高效抑制作用。多项研究也表明PPⅠ能以低剂量诱导多种癌细胞凋亡,并可抑制肿瘤的生长、转移和逆转耐药等[9-13]。因此,我们推测PPⅠ也能够通过相关凋亡通路诱导DU145细胞凋亡,抑制癌细胞的增殖,发挥其抑制肿瘤的作用。

ERK1/2是MAPK信号通路的重要一员,参与细胞分裂、分化、凋亡、转移、自噬及免疫等方面的调控,ERK1/2相关通路激活后可明显抑制包括PCa在内多种肿瘤的发生、发展,是治疗肿瘤的关键靶点[14-15]。本研究结果显示,随着PPⅠ给药浓度增加,细胞内p-ERK1/2与ERK1/2的表达逐渐上调,提示PPⅠ可通过调节ERK1/2通路来诱导DU145细胞调亡。

SP1是一种特异性DNA结合蛋白,广泛存在于细胞核内,可通过多个信号通路包括ERK1/2通路来调控血管生成、细胞周期、癌和抑癌基因等因子的转录及表达,从而促进肿瘤细胞的增殖及转移,并抑制肿瘤细胞的凋亡[16-17];而EZH2是一种重要的甲基转移酶,其作为核心催化亚基与其他成员形成PRC2,并通过调控转录活性进而促进肿瘤细胞的增殖、转移、耐药及抑制凋亡。有研究发现EZH2在PCa细胞中过表达或产生突变,这与肿瘤的发生、发展及不良预后密切相关[18]。本研究结果显示,细胞内SP1与EZH2蛋白的表达随PPⅠ给药浓度的增加而逐渐降低,提示PPⅠ可调控SP1和EZH2的表达,在此基础上,我们猜测ERK1/2可能是SP1与EZH2的上游调控蛋白。

本研究加入ERK1/2抑制剂(PD98059)后,发现其逆转了PPⅠ对SP1表达的下调作用,证明了ERK1/2可调控SP1的表达;同时, SP1过表达可逆转PPⅠ对EZH2表达的下调、逆转PPⅠ对EZH2启动子活性的抑制作用,而EZH2过表达未能逆转PPⅠ对SP1表达的下调,提示了SP1是EZH2的上游调控因子和上游促肿瘤细胞生长因子,而EZH2则是SP1的下游因子,与已有研究相符[19-21]。

综上所述,PPⅠ诱导CRPC DU145细胞早期调亡和抑制其增殖的机制可能是通过调控ERK1/2、SP1与EZH2信号通路实现的。但细胞内蛋白多样且作用复杂,各类肿瘤细胞发生、发展及代谢都存在差异,PPⅠ是否真正通过对上述蛋白的调控机制来诱导DU145细胞凋亡仍未能明确。后续研究仍需深入探究PPⅠ、ERK1/2、SP1、EZH2与真核细胞内的各种凋亡因子之间的相关性,以明确PPⅠ是否可通过调控ERK1/2、SP1与EZH2信号通路来诱导DU145细胞凋亡。同时,本研究仅在细胞水平进行探索,下一步仍需进行裸鼠荷瘤实验验证PPⅠ的抗癌活性与浓度普适性,从而为开发和利用PPⅠ治疗PCa提供理论依据。

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