淡水螯虾类胚胎离体孵化技术研究进展

程 顺，韦永春，蒋文枰，迟美丽，刘士力，郑建波，杭小英，彭 苗，李 飞

（浙江省淡水水产研究所/农业部淡水渔业健康养殖重点实验室/浙江省淡水水产遗传育种重点实验室，浙江 湖州 313001）

目前具有市场前景的淡水经济螯虾类主要有克氏原螯虾（Procambarus clarkii）、红螯螯虾（Cherax quadricariratus）、亚比螯虾（Cherax destructor）、通讯螯虾（Pacifastacus leniusculus）、奥斯塔欧洲螯虾（Astacus astacus）、格鲁西东欧螯虾（Astacus leptodactylus）、麦龙螯虾（Cherax tenuimanus）等，其中克氏原螯虾与红螯螯虾在我国产业化发展呈急速上升趋势[1-2]。但它们特有的生物学特性，即胚胎发育时间过长、个体抱卵量偏低导致在大规模生产育苗中出现出苗同步性差，导致出苗量偏低，这极大阻碍了这些淡水螯虾类产业化发展。其中克氏原螯虾、红螯螯虾等淡水螯虾类的繁育方式主要有室内工厂化水泥池繁育、室外土塘繁育等[3-6]。而国内目前更趋向于室内工厂化水泥池育苗，因为该繁育方式孵化率与出苗率更高，有利于规模化供苗，且环境可控，集约化程度相对高，特别是对于红螯螯虾等热带性品种更宜采用该方式[7]。但室内工厂化水泥池繁育也存在一些问题，该方式需要占用大量水泥池用于抱卵虾及幼虾的培育，且繁育期间需消耗大量人力、物力、用水及能源，不利于实现数字渔业与智慧渔业的要求。因此，亟需有针对性开发新的技术，解决淡水螯虾类的繁育中的瓶颈。胚胎离体孵化技术目前已被应用于淡水螯虾类繁育中，该技术不仅环境易控，节省人力、物力、占地与用水，还可有效提高孵化效率，减少饲养管理成本，并可发展“订单育苗”“反季育苗”等，有利于实现繁育智能化与自动化，批量化生产优质苗种[8-10]。与淡水鱼类相比，淡水螯虾类胚胎离体孵化困难更大，因为自身的生物学特性及孵化时间更长，期间需要更为适宜的环境控制、人工管理及消毒处理等[11]。因此，有必要对淡水螯虾类的相关生物学特性、离体孵化期间环境的控制、消毒等人为调控、孵化装置的设计等环节进行更加深入系统研究。淡水螯虾类的首次胚胎离体孵化于19 世纪发生在奥斯塔欧洲螯虾（Astacus astacus）中[12]，随后Paris 于20 世纪初用鱼卵孵化器孵化了白爪螯虾（Austropotamobius pallipes）离体胚胎，但均未获得实质性突破[13]。在国内，朱玉芳等[14]于2002 年尝试克氏原螯虾胚胎的离体孵化，也未获得成功，抱卵孵化的孵化率远高于离体胚胎的孵化率。王庆[15]的研究进一步验证克氏原螯虾胚胎可在离开母体后孵化，但总体上孵化率较低，仍不能应用于规模化育苗。首次取得成功的是Brian等[16]对亚比螯虾的研究，离体胚胎的孵化率达87%，与亲虾抱卵的孵化率接近。红螯螯虾胚胎离体孵化的研究起步则相对较晚，King 等[17]使用静态的充气悬浮上升系统首次进行该虾的胚胎离体孵化尝试，但未获得成功。直到21 世纪之后，在Rudge、Joly与Clive等[9,18-19]共同努力下，红螯螯虾胚胎离体孵化技术才取得了突破。

胚胎与初孵幼虾生物学上的成功探索是取得离体孵化突破的关键。Winnicki 等[20]研究认为，自然母体抱卵孵化和离体孵化的效果差异是因为前者是在理想的母体中自然孵化的，孵化区域由母体通过卷曲腹部构成，在整个孵化期内，胚胎与初孵幼虾始终附着在该区域；
而离体孵化的胚胎若因为人为剥离或其他外力原因造成外膜结构的机械性地破坏，将影响胚胎与水的交换，且易被细菌、真菌等感染。王吉桥等[21]发现母体和胚胎之间有四点联系，一是腹肢上的刚毛细长，附着面积大，可有效保护胚胎；
二是刚毛可使胚胎成排排列，互不黏连，利于胚胎与外环境间的交流；
三是刚毛可感知水流、水压和水质变化，通过腹部与附肢的摆动使胚胎免受机械等损伤；
四是腹肢节律性扇动，保持水体局部流动，可降低胚胎因局部缺氧死亡的几率。Shui等[22]研究表明淡水螯虾类母体在产卵的同时会分泌大量黏液，这些黏液对卵附着于步足起重要作用；
同时他们的研究还表明母体孵化的胚胎抗感染能力强于离体孵化。其他研究也表明，在母体孵化期间，淡水螯虾类的母体会通过如隐藏、清洁、转移和扇动腹部等行为护卵[23]。这些发现为此后离体孵化的研究提供3 点重要参考：1）胚胎在孵化阶段不能大面积黏连或沉底，需要与水进行充分的交流以保证溶氧；
2）胚胎在孵化阶段需要通过保护措施使其免受机械等损伤；
3）轻柔的滚动或摆动更有利于孵化效果的提高。

Clive 等[19]对孵出后幼虾的发育时期进行规定，第一期幼虾指刚破膜孵出的幼虾，蜕壳后成为第二期幼虾，再次蜕壳后成为第三期幼虾，第三期幼虾已能自由游动，标志着离体孵化的结束。还有研究表明不同发育时期的幼虾运动特征不同，第一期幼虾通常钩在合适的基质上，并在蜕壳进入第二期之前几乎静止不动，在这一阶段，所有定位和感知环境信号所必需的器官，即眼睛[24]、平衡囊[25]、嗅觉感受器官[26]、第一、二触角上的触觉以及水动力感受器刚毛[27-28]和正在形成中的游泳器官[29]等只有部分或根本没有发育，使其不能在自然界中独立生活；
但第一期幼虾拥有足够的卵黄储备，可以在无捕食者的体外系统中生存，通过避免运动将能耗降至最低[23]。第二期幼虾运动能力增强，特别在离体孵化期间可频繁移动改变位置，但由于尾节和平衡囊发育不完全，步行和游泳协调性较差。第三期幼虾相对于前两期的幼虾具有更强的运动能力[23]。Ⅴogt[23]发现淡水螯虾类在初孵幼体阶段有一条尾节线，它将幼体固着在母体上，防止其被水流冲走，第一期幼虾被尾节线固定，基本不运动；
第二期幼虾控制平衡的平衡囊发育不完全，运动能力较差；
第三期幼虾口器和胃磨已发育完全，可摄食，并自由运动。上述研究提示：1）第三期幼虾可自由运动及摄食，需及时取出进行中间培育或暂养标粗，避免自残与饥饿；
2）尽量使同一个孵化区域同步性保持一致；
3）实际离体孵化期间可添加网片、海绵等附着基质代替尾节线与附肢刚毛；
4）离体孵化期间应降低水环境的冲击，避免使第一期与第二期幼虾脱离附着基质。

2.1 水温

王吉桥等[21]研究表明，温度是制约离体胚胎孵化的重要因素，水温低则胚胎孵化所需时间延长，但水温过高易引起水质恶化而导致离体胚胎死亡。李水根[30]研究发现红螯螯虾胚胎在水温20～32 ℃条件下，孵化时间为4～13 周，并认为在22～30 ℃范围内，提高水温有利于其孵化。李进等[31]研究结果显示，在水温18 ℃时，红螯螯虾胚胎可以发育，但孵化期较长，当超过30 ℃以后，胚胎发育畸形率增加，孵化率呈下降趋势，且温度对胚胎孵化时长影响较大，这与梁俊平等[32]及曹林泉等[33]对其他虾类研究相一致，并认为这可能是两个原因所导致，一是水温升高会导致胚胎代谢加速，但机体各组织器官发育又不完善，引发各器官衰竭；
二是过高水温可能会导致机体代谢相关酶及其他大分子物质活性的降低。同时，在离体孵化期间，细菌、真菌等不利微生物生长会随温度升高而增加[34]。在胚胎孵出后，初孵幼虾也会受到温度影响，彭刚等[35]研究发现，红螯螯虾幼虾随水温上升新陈代谢加快，需消耗大量营养物质，若营养物质积累不足，易导致其无法正常蜕壳，所以水温超过30 ℃幼虾死亡率会上升。因此，水温对胚胎孵化、胚后发育均具有影响，而且水温稳定（温差不大于3 ℃）也是孵化成功与否的重要因素[36]。

2.2 水质

Antonín 等[37]在未进行甲醛浸泡消毒的情况下通过半循环系统离体孵化奥斯塔欧洲螯虾胚胎，因水质条件恶化，导致孵化效果较差，并出现幼体无法成功蜕壳、幼体腿部畸形和幼体培养死亡率升高等异常现象，推测这是由于真菌感染可导致生物降解的有机物从胚胎释放到水环境中引起了水质恶化；
同时他们认为在半循环系统中，水质是最大的挑战，可以通过更大的水交换来解决，在NO2中毒的情况下，也可以通过添加氯离子或将生物过滤介质上的硝化过程纳入系统来解决。Antonín 等[38]与Policar等[39]也得到了类似结论。Rudge等[9]与Carral等[40]也认为维持良好、清洁的水质是进行胚胎离体孵化的前提条件。目前去除水质不利因素的方法主要有这几点：1）定期换水，排出部分孵化用水，加入经过消毒的清洁水；
2）加入过滤及净化水的物质，通过滤膜培养硝化细菌等有益菌，维持水生态稳定；
3）在不影响水生态平衡的前提下对孵化用水进行紫外或臭氧消毒；
4）Antonín等[37]提出可通过添加氯离子以降低水中亚硝酸盐等的毒性。

2.3 菌群环境

水生动物胚胎的表面是细菌定植的良好基质[41]，其表面细菌的组成可以反映周围水域的菌群环境，并且胚胎表面相关条件致病菌的存在会影响它们的生存能力和以后发育[42]，一些水生动物早期生命阶段的密集培育所带来的许多问题都是由细菌引起的，因此离体孵化阶段菌群环境对孵化具有重要影响[41]。Micknien 等[43]介绍人工孵化的奥斯塔欧洲螯虾胚胎表面异养细菌丰度的数据，在第一期幼虾上观察到异养细菌的丰度最高，而孵化器系统水中的细菌数量远低于胚胎上，死胚的细菌数量比健康胚胎高100 倍；
死胚上色素细菌的丰度也远远高于健康胚胎；
气单胞菌和假单胞菌在胚胎中占有优势，占鉴定的所有细菌的70%。还有研究观察到胚胎刚产出时是无菌的，但释放到环境中才被细菌定植，母体用它的步足摆动可能有助于限制细菌数量，因此了解螯虾如何与周围环境中的细菌相互作用具有重要意义[44-45]。Stevenson 等[46]离体孵化红螯螯虾时发现细菌性疾病导致的大量死亡是一个问题，他们在初孵幼虾蜕壳期间的后肠内观察到细菌，这些细菌主要为一种强烈溶血性的嗜水气单胞菌。Clive 等[19]利用循环水+机械拉动装置（Clive 等将其命名为AquaⅤerde Incubator）离体孵化红螯螯虾胚胎，虽然一个批次可平均生产18 万尾幼虾，但同时也发现有时卵或幼虾会出现大批量死亡现象。他们推测造成这一现象的原因是菌群环境的变化，即细菌（特别是嗜水气单胞菌）的滋生，因此他们采取使用经臭氧消毒的水、接种噬菌体及其他消毒措施，改善了孵化效果。Olafsen[42]指出，在离体孵化期间，经过消毒的胚胎表明菌群多样性会降低，使其易受到进一步潜在致病微生物的感染，因此有必要进行定期消毒并对淡水螯虾类胚胎表面正常菌群区系的性质进行深入研究。

2.4 溶氧

朱玉芳等[14]研究认为克氏原螯虾母体抱卵孵化的孵化率高于胚胎离体孵化的孵化率的原因之一，是抱卵时母虾附肢的摆动为胚胎提供了更多的溶氧。阎斌伦等的研究表明，虾蟹类的胚胎与母体以刚毛连接，通过腹肢摆动保证胚胎发育过程中氧气的充足[47]。王吉桥等[21]也认为在进行胚胎离体孵化时，尽量避免胚胎因局部缺氧死亡是最应该考虑的问题。王庆[15]研究结果则显示，充气孵化方式的胚胎孵化率高于静水孵化方式，这是因为前者水体中溶氧含量更高。因此，溶氧是影响离体胚胎孵化的重要因素之一，为避免在实际孵化过程中胚胎因缺氧死亡，可以尝试循环水或充气悬浮系统，以提供尽可能充足的溶氧。

通过上述研究，本研究认为有必要做好这几点：1）水温控制在适宜水平；
2）水质良好、清洁，溶氧充足，亚硝酸盐、氨氮、pH 等指标稳定在较低水平；
3）离体孵化期间经过消毒的胚胎表明菌群异质性会降低，应进行定期消毒防止致病微生物的传染。

3.1 消毒剂的筛选

红螯螯虾等淡水螯虾类在抱卵过程中会经常扇动尾部和附肢，除可增氧外，还能清除胚胎上的污垢及死胚，防止健康胚胎遭受真菌等微生物感染，但在进行离体孵化时缺少该过程。定期清除死胚是控制真菌等生长的有效方法，但这种做法需要大量人力，不当处理可能会损害健康胚胎，特别在卵量大、密度高时，这些缺点更为明显[48]。Royuela等[11]认为与淡水鱼类相比，人工孵化淡水螯虾困难更大，因为其胚胎发育时间更长，使用与鱼类消毒一样的消毒剂浓度和消毒频率处理可能会无效，特别在高密度下，适宜消毒处理方法是使离体孵化成功的关键因素。

目前取得较好效果的消毒剂包括甲醛、溴硝丙二醇、乙醇、氢氧化铜、金合欢精油等。甲醛是在胚胎离体孵化中使用最为广泛的消毒剂，Antonín等[37-38]认为甲醛是一种有效杀菌剂，可有效减少胚胎感染，可成功在半循环系统中孵化奥斯塔欧洲螯虾胚胎。Rocío等[49]对通讯螯虾的研究认为，人工孵出的幼虾生长速度明显快于母体孵化出的幼虾，表明甲醛的消毒处理对幼虾无不良影响，且可使幼虾获得更好的生长潜能。Celada 等[48]使用甲醛、过氧化氢、氯化钠等作为消毒剂，对通讯螯虾胚胎进行离体孵化实验，结果证明使用体积分数4 500×10-6甲醛与质量分数15×10-6孔雀石绿可以达到最高出苗率，且二者都能有效抑制真菌生长；
而使用体积分数1 500×10-6甲醛、1 000×10-6过氧化氢、3 000×10-5氯化钠，则不能控制真菌蔓延，出苗率质量分数较低。Melendre 等[34]研究甲醛、孔雀石绿、过氧化氢、异丙醇、硫酸铜、高锰酸钾和聚维酮碘对通讯螯虾胚胎离体孵化的消毒效果，结果表明，体积分数3 000×10-6的甲醛是最有效的杀菌剂，完全可以取代禁用的孔雀石绿，其他化学试剂如过氧化氢、高锰酸钾、硫酸铜、聚维酮碘或异丙醇等则效果较差。但由于甲醛使用不当有可能致癌或有潜在对水生环境的不利影响[34]，研究者也尝试了其它消毒剂，González等[50]对通讯螯虾的研究表明溴硝丙二醇是较好消毒剂，即使在高密度孵化过程中，每日使用体积分数3 000×10-6的溴硝丙二醇消毒15 min 可以取得较好效果。Lio-Po 等[51]与Cheng 等[10]报道乙醇在很高浓度下是真菌抑制剂，后者研究也表明，使用体积分数75%乙醇对红螯螯虾胚胎消毒1 min 有助于提高孵化率及出苗率。Carral 等[40]对通讯螯虾胚胎离体孵化的结果表明，质量分数200×10-6的氢氧化铜（孵化率达86.2%、出苗率达77.6%）与体积分数3 000×10-6甲醛（孵化率为83.7%、出苗率为74.3%）效果无显著差异（消毒剂隔天处理一次15 min），是甲醛的良好替代品。Seval 等[52]研究表明，体积分数1 000×10-6的金合欢精油处理离体孵化的格鲁西东欧螯虾（Astacus leptodactylus）胚胎，其孵化率可以提高至86%。2023 年，Cheng 等[53]报道了以金合欢精油基础液体积分数1 000×10-6，SOD 超氧化物歧化酶10 000 U/mg，海藻糖30 mmol/L，牛血清蛋白200 mmol/L，虾青素30 mmol/L作为消毒剂具有较高孵化率与出苗率，可以作为替代传统甲醛的一种无公害、有效的红螯螯虾胚胎离体孵化消毒剂。

总之，消毒剂使用被认为是淡水螯虾类胚胎离体孵化成功与否的关键因素之一，其中体积分数3 000×10-6甲醛浸泡消毒离体胚胎15 min 是大多数研究中选择的消毒方法，但体积分数75%乙醇、体积分数3 000×10-6溴硝丙二醇等消毒剂也被部分研究认为效果较佳，特别是近年来，研发替代甲醛的绿色无公害消毒剂可能是今后淡水螯虾类胚胎离体孵化的重点领域。

3.2 水体消毒

对霉菌和病菌的有效防控以及对不良水质因子的有效处理是离体孵化过程中关键技术环节之一。但由于水体消毒不宜将硝化细菌、光合细菌等有益菌杀灭，因此不建议加入过多化学消毒剂。目前常用水体消毒方式包括紫外照射消毒与臭氧消毒。

紫外照射消毒是目前最常使用的水体消毒方式，对水产养殖品种已证明能有效控制病原[54]，通常用于循环系统中鲑（Oncorhynchus keta）胚胎的人工孵化[55]。在淡水螯虾类离体孵化的研究中，Antonín等[37]研究表明，真菌会导致胚胎死亡，解决这个问题的主要方法除使用化学抗真菌剂对胚胎进行浸泡消毒外，还可以通过紫外线照射孵化水体，达到对病原菌的抑制作用。同时，Antonín等[37]也认为紫外照射会提高氨氮和亚硝酸盐含量，因为水中的微生物经过紫外处理被杀死后可以作为剩余微生物群落生长的合适基质。

臭氧的强氧化性可破坏病毒的RNA 或DNA，从而达到灭活病毒的作用；
臭氧也可作用于细胞膜，使细胞膜的通透性发生改变，导致细胞溶解、死亡，从而杀灭细菌、霉菌等病原生物。特别是臭氧使用后最终会分解为氧气，不会造成二次污染，具有无公害特点，在欧盟、美国、日本等地臭氧已经被广泛应用于水产养殖循环水处理系统中[56]。但其具有强烈氧化作用，臭氧在氧化细菌细胞膜及体内活性基团发挥杀菌作用的同时也会对胚胎发育产生一定毒性作用，导致胚胎发育滞后、畸形或死亡[56]。刘淇等[57]研究发现卵膜有一定保护作用，胚胎发育阶段对臭氧耐受能力强于幼体阶段。郑锦滨等[56]研究认为臭氧的水处理效果良好，0.30 mg/L 的臭氧在3 h 内对水中亚硝酸盐的去除率可达72.29%，0.05 mg/L 的臭氧处理20 min 后也能完全杀灭弧菌，但高质量浓度臭氧（0.30 mg/L）对胚胎发育具有一定毒性。目前，将臭氧应用于淡水螯虾类胚胎离体孵化的水体消毒报道仅见于Cheng等[10]对红螯螯虾的研究中，该研究结果表明，臭氧消毒是一种有效水体消毒方式，它不仅能像紫外照射消毒一样杀死水体中有害病菌，还能杀灭附着于装置四周内壁的病菌，在合适的浓度范围内效果更佳。

3.3 胚胎发育阶段的选择

淡水螯虾类胚胎的发育阶段大致可通过颜色区分，以红螯螯虾为例，孟凡丽等[58]研究表明，刚产出的卵呈乳白色或淡黄色（Ⅰ期），随后颜色加深，至囊胚期呈橄榄绿色（Ⅱ期），从原肠期到孵出前，胚胎体表颜色依次为黄绿色或黄褐色（Ⅲ期）、土黄色或中褐色（Ⅳ期）、桔黄色或深褐色（Ⅴ期）、桔红色（Ⅵ）、红色或红褐色（Ⅶ），之后可以观察到眼点，到达眼点期（Ⅷ期），此时即将孵出。不同发育阶段的胚胎进行离体孵化效果也有差异，王吉桥等[21]认为当胚胎死亡时，真菌迅速繁殖，同时菌丝长出，附近正常的胚胎也因菌丝覆盖而窒息死亡，且离体胚胎易受真菌感染而死亡，造成离体培养的早期胚胎孵化率较低。王庆[15]比较了不同时期的克氏原螯虾胚胎离体孵化的效果，结果表明早期胚胎孵化率低，至胚胎呈桔红色后孵化率较高，说明后期胚胎的孵化效果较好。但Perez 等[59]对白爪螯虾（Austropotamobius pallipes）胚胎离体孵化的研究则认为早期胚胎进行离体孵化也可获得较高孵化率（67.7%）及出苗率（51%）。在最新研究中，Cheng 等[10]认为发育后期的胚胎孵化效果明显优于早期胚胎，该研究推测可能是因为早期胚胎在剥离时较易受损，且孵化期间卵膜的坚固性不如后期胚胎，从而造成部分胚胎膜受损而死亡或被感染。Shui等[22]研究表明克氏原螯虾不同的胚胎剥离阶段会对离体孵化结果产生影响，其中有一个关键时期，即原肠胚期，孵化率从原肠胚期之前的24%增加到45%，因此在原肠期之前进行离体孵化效果较差。总之，本研究认为选取后期的桔黄色或桔红色胚胎进行剥离有助于离体孵化效果的提高。

3.4 密度

淡水螯虾类死亡的胚胎是霉菌的良好基质，霉菌能够从受感染的胚胎传播至周围的健康胚胎，从而影响离体孵化的效果，当胚胎密度较大时，该现象则更为明显[11,50]。Cheng 等[10]在进行红螯螯虾胚胎离体孵化的研究中发现，密度是离体孵化的影响因子之一，低密度组（300 粒胚胎/孵化器）与中密度组（600粒胚胎/孵化器）的孵化率及出苗率均高于高密度组（900 粒胚胎/孵化器）。Celada 等[48]也报道了胚胎密度对离体孵化具有较大影响，并推测密度的降低有助于胚胎间隔的扩大，进而避免真菌生长到达周围健康胚胎，从而提高离体孵化效果。因此，在离体孵化前需要探索适宜的密度，以提高孵化率与出苗率。

3.5 其他人工管理措施

主要包括定期清洁、换水、挑死胚、挑第三期幼虾、添加附着物等，这些措施也是决定孵化成功与否的关键。

由于死胚或者受伤的胚胎可能会被细菌、真菌感染[34,40]，而人工剥离难免会造成少量胚胎受损，因此前期管理非常重要。Rudge 等[9]每5 周清洗将会对孵化装置进行一次清洁，该措施有效解决了长期孵化造成的病菌滋生问题。有研究表明定期清除死胚、死虾是控制病菌滋生的有效方法，因为在孵化过程中，病菌会从死胚扩散到健康的胚胎上，定期去除有助于减少感染源[37,48]。Sahul-Hameed[60]研究也表明，早期清除死亡胚胎和碎屑可以防止细菌增殖。在奥斯塔欧洲螯虾人工孵化的研究中，胚胎浸泡消毒和每日清除死胚均会提高孵化成功率和出苗幼虾产量，其中去除死胚后的孵化率高于胚胎浸泡消毒的孵化率[39]。因此孵化期间需及时清除死胚以保证霉菌等不产生。Melendre 等[61]研究发现，当胚胎发育不同步时，通过每天将第三期幼虾幼虾取出可以获得较高出苗率，并观察到第三期幼虾会抓取并摄食早期幼虾或同为三期的幼虾，如果它们不被移除，它们在孵化器中的数量会随新的蜕壳发生而增加，这也会增加攻击行为和同类相食的频率。Celada 等[48]与Melendre 等[34]的研究也表明第三期幼虾、初孵幼虾、胚胎之间的共存可能会导致出苗的幼虾摄食未出苗的幼虾或胚胎，因为在第一次蜕壳后，自由活动的幼虾已经开始早期摄食，因此建议孵化期间胚胎的同步性保持一致。Ⅴogt[23]发现初孵幼虾主要依靠第一步足牢固附着于母体腹部刚毛，这种附着意义重大，因为它们通过附着于母体得到保护及适宜的溶氧与栖息环境，避免运动，将能耗降至最低。Cheng 等[10]在红螯螯虾胚胎离体孵化时在孵化器内加入了15～25 个小网片取得较好效果，并认为加入网片的作用是增加附着物，避免抱团中间的胚胎或虾因缺氧死亡发霉，造成健康的胚胎或虾被传染。因此添加合适的附着物具有创造适宜的栖息环境、保护幼虾、防止缺氧及霉菌等的传播等作用。Cheng 等[62]运用循环水+机械拉动装置对附着物进行了探索，结果表明在孵化盒内插入细海绵条，可解决幼虾孵出后幼虾因为于孵化盒内壁上磨擦碰撞损伤而造成损耗的问题，因为幼虾附着在细海绵条上，细海绵条即可充当母虾腹足的作用，定期抖动，还柔软有弹性，在抖动中起到幼虾与孵化盒内壁的缓冲间质作用，这可以大幅减小幼虾于内壁上磨擦碰撞损伤，从而可以显著提高出苗率。

Perez 等[59]于20 世纪就提出孵化装置对淡水螯虾类胚胎离体孵化的作用。Joly 等[18]研究认为红螯螯虾等淡水螯虾类的养殖技术已经较为成熟，下一步关键是开发适宜的孵化装置。目前在淡水螯虾类胚胎离体孵化中取得过成功的装置主要有四种：充气悬浮上升装置、反气举装置、循环水装置、循环水+机械拉动装置。

4.1 充气悬浮上升装置

Brian 等研究认为充气悬浮上升装置可成功应用于亚比螯虾胚胎的离体孵化。该装置的原理是通过底部充气使胚胎悬浮，从而为胚胎提供良好的水和氧气，并避免了胚胎与可能会被细菌或寄生虫感染的表面接触[16]。但是此前的研究中，King[17]和Caceci等[63]使用静态的充气悬浮上升装置孵化淡水螯虾类胚胎均未获得成功，而Carral 等[64]采用充气悬浮上升装置，上升流流速仅为0.5 L/min，胚胎不产生运动，却能够获得85%的孵化率。因此，该装置的孵化稳定性仍需加强。

4.2 反气举装置

该装置优化了充气悬浮上升装置，不仅多了对流，而且其内部水流更大，同时，气流从下往上，水流则从上往下，水与氧充分融合。Cheng 等[10]利用反气举法原理，使红螯螯虾胚胎在一个可控制的动态水流中处于不断翻滚的状态，从而形成一个稳定的循环水流，使胚胎均匀而轻柔地翻动，这为胚胎提供了一个高氧孵化环境，且翻动的胚胎基本散开，有效抑制病菌的传播。通过该反气举装置，胚胎孵化率在80%以上、出苗率55%以上，共孵出SPF虾苗10.65万尾。

4.3 循环水装置

近年来循环水装置被应用于淡水螯虾类胚胎离体孵化的研究，这类装置通过生物过滤和水循环设备保证孵化用水的质量，并有助于节水[37]。Antonín 等[37]与Antonín 等[38]离体孵化奥斯塔欧洲螯虾胚胎的结果表明循环水装置可成功地用于该虾。Royuela等对通讯螯虾（P.leniusculus）胚胎离体孵化进行了研究，胚胎放置密度分别为6.6、20与42 cm-2，水流速分别为0.5 和1 L/min，消毒剂甲醛浓度分别为体积分数2 500×10-6和3 000×10-6，结果表明，在密度20 cm-2，水流速为0.5 L/min，消毒剂为体积分数2 500×10-6甲醛（隔天消毒一次，每次15 min）时，出苗率最高，达到88.8%[11]。

4.4 循环水+机械拉动装置

该装置是对循环水装置的优化升级。Rudge等在比较充气悬浮上升装置、胚胎置于网上+底下充气的装置及循环水+机械拉动装置（Rudge等将其命名为Hemputin）后，发现后者效果明显优于前面两者。该装置是通过一个连接到架子上的电动机使孵化盒前后上下摇动，从而模仿在母体中的抱卵环境，出苗率从母体孵化的55%提高至65%[9]。Clive等[19]利用循环水+机械拉动装置（Clive 等将其命名为AquaⅤerde Incubator），装置主体由一个浅的矩形不锈钢槽组成，长3 m，宽60 cm，深15 cm，槽内部不锈钢框架被设计成可容纳一定数量的孵化盒，整个框架与一个电动拉杆连接，来回运动使孵化盒在水中来回摆动，模仿抱卵虾附肢的摆动，通过该装置一个批次可生产约18万尾幼虾。Cheng等[62]运用循环水+机械拉动装置共培育红螯螯虾SPF幼虾240 031尾，孵化率达（85.34 ± 4.56）%，出苗率达（61.31 ±9.58）%。总体上该装置具有以下优点：1）批量化供苗能力大幅提高；
2）易于选取同步出苗的幼虾；
3）出苗量清晰可控；
4）有利于实施无特定病原苗种传代；
5）大幅减少人工，智能化与自动化程度高。

综上所述，这四类孵化装置各有优点，但笔者认为反气举装置与循环水+机械拉动装置具有更广阔的应用前景，特别是循环水+机械拉动装置，批量化生产效果最好。同时，在进行胚胎离体孵化时，正如Antonín 等[38]提出的设想，还需要进行以下探索：1）探讨胚胎表面正常菌群的地位和作用以及消毒剂对其的影响；
2）研究真菌从受感染胚胎传播到新宿主途径；
3）长期监测亚硝酸盐与氨氮等水质条件对胚胎孵化和胚胎后发育的影响，并在循环水装置运用生物过滤器等过滤或净化水的部件，以用来稳定硝化作用、防止水质恶化和减少病菌的潜在定殖。

今后离体孵化的目标是要解决阻碍红螯螯虾等淡水螯虾类产业化发展的出苗量不足等问题，将离体孵化技术更好地应用于实际生产，并深入思考以下三个问题：1）如何将离体孵化期间的水质指标稳定保持在一个适宜的范围；
2）如何在大规模生产中，运用更高效的装置实现离体孵化的智能化、数字化，批量化生产优质苗种；
3）如何控制胚胎或幼虾死后病菌的滋生，实现孵化率与出苗率的提高。针对上述问题，笔者认为，首先必须明确水质指标等环境因素适宜的范围及最适值，并通过定期换水、消毒创造清洁、无污染的水环境，同时加入过滤及净化水的部件，通过滤膜培养硝化细菌等有益菌，维持水生态的稳定。其次，在规模化生产中，有必要应用适合的离体孵化装置的同时探讨离体胚胎应对不同外界因素的生理生化或分子层面的内在机制，胚胎表面正常菌群的地位和作用以及消毒剂对其的影响，添加生物过滤器等控制硝化作用、水质恶化和病菌的潜在定殖，真菌从受感染的胚胎传播到新宿主的途径等更深层次的问题，并进行跨学科的融合，建造智能化离体孵化车间，实现离体孵化的智能化、数字化、批量化，即可以基于离体胚胎孵化平台，通过物联网技术将水质传感器、增氧设备、控温装置、自动化挑卵装置、水循环等设备集成，实现对当下离体孵化生态数据的实时采集，辅助管理人员对当下孵化情况的实时掌握，提高生产效率，保证生产安全，并通过对整个孵化环境的具体指标监控，可以对水质、溶氧、温度和养殖设备是否正常运行进行监控，还能对水质指标阈值进行设置，对突发事件及时响应。最后，继续筛选更好的消毒剂与消毒方法、孵化密度、胚胎剥离阶段等，确定最适人为调控方法，并根据死胚透明度或折光度的变化，运用智能化挑卵装置实现批量化、机械化挑除死胚，避免死胚造成的病菌滋生，实现孵化效率质的提升。

综上所述，目前红螯螯虾等淡水螯虾类产业发展的瓶颈主要表现在苗种孵化期间，苗种孵化率低与出苗不同步、单位水体出苗量低、育苗占用空间大、人力投入量大等原因导致的苗种规模化供应不足及价格较高等问题。因此，今后有必要针对上述实际生产中的这些问题进行研究。离体孵化技术的应用可以节省人力、物力、占地与用水，还可有效提高孵化效率，减少饲养管理成本，并可发展“订单育苗”“反季育苗”，有利于实现繁育的智能化与自动化，批量化生产优质苗种，今后需要在离体孵化装置的优化、离体孵化期间水质与菌群环境的维持、死胚与死虾的挑除、苗种生产的批量化与智能化等方面进行深入研究，实现孵化效率质的提升，使其更好应用于实际生产。

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