郑雨晴，王小永
（华东理工大学化学与分子工程学院，上海 200237）
姜黄素（Curcumin）是一种天然植物多酚，在许多生理和药理实验中已被证实具有抗癌、抗氧化以及抗阿尔兹海默症等重要活性[1-3]。自20 世纪以来，姜黄素一直受到国内外学者的广泛关注。姜黄素分子含有芳香环和双键，这是姜黄素具有生理和药理活性的分子结构根源。但是，与其他高疏水性多酚化合物类似，姜黄素在水溶液中的溶解度低、稳定性差，严重限制了姜黄素的实际应用效果[4]。
胆酸盐、十二烷基三甲基溴化铵、吐温-20 等表面活性剂可以通过疏水、氢键和静电等弱分子间作用力对姜黄素进行包载，从而有效提高姜黄素的溶解度、稳定性和生物利用度[5-7]。刘调调等[8]制备了十二烷基三甲基溴化铵/吐温-80 混合胶束，发现两种表面活性剂之间的偶极-离子作用有利于提高姜黄素的溶解度。Leung 等[6]发现带正电荷的烷基季铵盐表面活性剂胶束可以与带负电荷的姜黄素产生静电吸引作用，能够抑制姜黄素的碱性水解，使姜黄素的稳定性提高了至少8 倍。本课题组在使用吐温表面活性剂包载姜黄素时，发现吐温表面活性剂的烷基链越长，越有利于姜黄素通过疏水作用包载于吐温聚集体中的疏水区域[9]。表面活性剂烷基链结构的变化不仅影响其生成的聚集体结构，也会改变活性分子的包载性能[10-11]。但烷基链不饱和度和烷基链数目对表面活性剂包载姜黄素的影响鲜有报道。
本文选择吐温-60、吐温-80 和吐温-85 3 种表面活性剂，探究烷基链双键和烷基链数目对表面活性剂包载姜黄素的影响。这3 种吐温表面活性剂具有相同的头基，但尾部烷基链结构不同：吐温-60 含有1 条C18饱和烷基链，吐温-80 的C18烷基链中含有1 个双键，而吐温-85 含有3 条与吐温-80 相同的不饱和烷基链。在表面活性剂浓度为1 mmol/L 时，吐温-80 在水溶液中生成胶束，而吐温-60 和吐温-85 生成粒径不同的囊泡。本文考察了姜黄素在3 种吐温聚集体中的稳定性和结合常数，并通过紫外吸收光谱、荧光发射光谱和核磁共振氢谱研究了姜黄素在不同吐温聚集体中的包载位置和作用力。
1.1 试剂
姜黄素（w=65%）、芘（w=99%）、吐温-60（Tween-60，w=99%）、吐温-80（Tween-80，w=99%），吐温-85（Tween-85，w=99%），均购于Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司；
重水（D2O,w=99%），购于北京百灵威科技有限公司。
1.2 表面张力的检测
使用表面张力仪（德国Dataphysics 公司 DCAT21型）测定吐温-60、吐温-80 和吐温-85 溶液的表面张力（γ）。测定过程中，使用恒温水浴控制样品温度为298 K。
1.3 粒径的测定
使用英国Malvern Delsa Nano 型动态光散射仪测定1 mmol/L 吐温聚集体的粒径。仪器温度调至298 K 后预热 30 min，样品恒温 5 min 后开始测定，每个样品测定 3 次以保证实验数据的准确性。
1.4 芘的微极性参数
以芘为荧光探针，使用荧光光谱仪（日本岛津Shimadzu RF-5301 型）测定芘的稳态荧光光谱。使用芘的微极性参数（I1/I3，即373 nm 和384 nm 处芘荧光发射强度比值）来表示吐温聚集体疏水区域的疏水性。样品中芘的浓度固定为5×10−7mol/L，激发波长为335 nm，扫描范围为350～500 nm，温度控制在298 K。
1.5 姜黄素的稳定性
将10 μmol/L 姜黄素分别加入到水和3 种吐温聚集体中。在298 K 下，根据姜黄素在425 nm 处的紫外吸收强度随时间的变化规律，考察姜黄素的稳定性。使用紫外光谱仪（日本岛津Shimadzu UV-1800型）测定姜黄素的紫外吸收强度的变化情况。
1.6 姜黄素的结合常数
将不同浓度的姜黄素（2～12.5 μmol/L）加入到水和3 种吐温聚集体中，在298 K 下，使用紫外光谱仪（日本岛津Shimadzu UV-1800 型）检测姜黄素在425 nm处的紫外吸收强度，并通过Benesi-Hildebrand 方程计算姜黄素与吐温-60 囊泡、吐温-80 胶束和吐温-85 囊泡的结合常数[12]。
1.7 姜黄素的紫外吸收和荧光发射光谱
在298 K 下，将10 μmol/L 姜黄素分别加入到水和3 种吐温聚集体中，使用紫外光谱仪（日本岛津Shimadzu UV-1800 型）测定姜黄素样品的紫外吸收光谱。同时，使用荧光光谱仪（日本岛津Shimadzu RF-5301 型）测定姜黄素样品的荧光发射光谱。测定过程中，紫外波长扫描范围为325～525 nm，荧光激发波长为425 nm，扫描范围为450～600 nm。
1.8 吐温表面活性剂样品的核磁共振氢谱（1HNMR）
对于包载和未包载姜黄素的吐温-60 囊泡、吐温-80 胶束和吐温-85 囊泡样品，使用核磁共振波谱仪（德国Brucker 公司Ascend 600 型）测定其1H-NMR。实验样品所用的溶剂为重水。
2.1 吐温表面活性剂的聚集过程
采用表面张力法研究吐温表面活性剂的胶束生成过程，结果如图1 所示。吐温-60、吐温-80 和吐温-85的表面张力随浓度对数的变化曲线均出现了明显的突变点，即为吐温的临界胶束浓度（CMC）。当吐温浓度低于CMC 时，吐温分子会自发地在溶液表面进行定向吸附，使溶液表面张力减小；
当吐温浓度高于CMC 时，吐温分子在溶液表面定向吸附达到饱和，同时在溶液内部生成吐温胶束，使溶液表面张力趋于稳定[13]。从图1 可得出吐温-60、吐温-80 和吐温-85的CMC 值分别为0.028、0.021 mmol/L 和0.018 mmol/L，与其他研究者使用表面张力、荧光光谱等方法报道的CMC 值接近[14]。相比烷基链长度相当的离子型表面活性剂，3 种吐温表面活性剂表现出极低的CMC 值[15-16]。由于其非离子性，吐温表面活性剂的极性头基之间不存在静电排斥作用，因而更容易在溶液中生成胶束。吐温-60 与吐温-80 头基大小和烷基链长度完全相同，但吐温-80 的表面张力值及CMC 值均小于吐温-60[17]，归因于吐温-80 烷基链中的双键引起的偶极-偶极相互作用[18]。虽然吐温-85 烷基链中含有双键，但是每个吐温-85 分子中含有3 条烷基链，这使其能够产生最强的疏水聚集作用。因此，吐温-85 在3 种表面活性剂中具有最小的表面张力及CMC 值。
图1 吐温-60、吐温-80 和吐温-85 的表面张力曲线Fig.1 Surface tension curves of Tween-60, Tween-80 and Tween-85
当表面活性剂浓度高于CMC 时，继续增大浓度能够使表面活性剂聚集体结构发生改变[19]。当表面活性剂浓度等于CMC 时，3 种吐温样品均为澄清透明溶液。随着表面活性剂浓度逐渐增大到1 mmol/L，吐温-80 溶液仍保持澄清透明状态，而吐温-60 溶液轻微泛蓝，吐温-85溶液呈现明显泛蓝状态且具有一定浊度（图2）。在1 mmol/L 时，不同表面活性剂样品的外观状态表明3 种吐温生成了不同的聚集体结构。由于对光线散射作用的吸收强度不同，表面活性剂球形胶束溶液通常呈现澄清透明状态，而表面活性剂溶液泛蓝是生成囊泡的主要特征之一[20]。为了进一步探究3 种吐温生成的聚集体结构，采用动态光散射仪测定了浓度为1 mmol/L的吐温-60、吐温-80 和吐温-85 的粒径分布曲线，结果如图3所示。可以看出，3 种吐温样品均具有单一的聚集体粒径分布，吐温-80 样品的粒径约为10 nm，而吐温-60 和吐温-85 样品的粒径分别约为92 nm 和150 nm。基于吐温分子尺寸、吐温浓度以及实验或计算机模拟方法，吐温球形胶束的粒径范围为4～10 nm[21]。Sahu 等[22]报道了浓度为1.25 mmol/L 时吐温-80 球形胶束的粒径约为9 nm，与吐温-80 样品的测定结果基本一致。因此，样品外观和动态光散射数据均可以说明吐温-80 在1 mmol/L 时生成了球形胶束，更高的粒径结果则说明吐温-60 和吐温-85 在浓度为1 mmol/L 时生成了更大尺寸的囊泡结构，这也与许多研究者使用光散射、电镜等方法报道的吐温囊泡的粒径范围相符[7, 23-26]。
图2 吐温-60、吐温-80 和吐温-85 在1 mmol/L 时的表观形貌Fig.2 Appearance of Tween-60, Tween-80 and Tween-85 at 1 mmol/L
图3 吐温-60、吐温-80 和吐温-85 的粒径分布曲线Fig.3 Size distribution curves of Tween-60, Tween-80 and Tween-85
不同结构吐温聚集体的生成可以利用临界堆积参数理论来解释[19]。表面活性剂的临界堆积参数P=V/（A0l）（V为表面活性剂烷基链的体积，A0为表面活性剂头基的有效横截面积，l为表面活性剂烷基链的长度）。当P小于 1/3 时，表面活性剂生成球形胶束；
当P为0.5～1 时，表面活性剂生成囊泡。根据吐温-80 分子的烷基链和头基数据，Amani 等[21]计算得到吐温-80 的P为0.07，此低P值可以解释吐温-80 胶束的生成。吐温-60 的烷基链中不含有双键，相比吐温-80 具有更高的柔软性，因而吐温-60聚集体容易由球形胶束转变为囊泡。相比吐温-80，烷基链的增多能够使吐温-85 的P值增大，更有利于球形胶束向囊泡的转变，从而生成了粒径更大的囊泡[27]。另一方面，由芘探针实验测定的吐温-80 胶束、吐温-60和吐温-85 囊泡的I1/I3值分别为1.28、1.23、1.13，说明其烷基链聚集区域的疏水性大小顺序为[28]：吐温-85囊泡 > 吐温-60 囊泡 > 吐温-80 胶束。
2.2 姜黄素在吐温聚集体中的稳定性
姜黄素的紫外-可见光吸收强度随时间的变化情况可反映姜黄素在吐温聚集体中的稳定性。图4 示出了10 μmol/L 游离姜黄素和吐温-60 囊泡、吐温-80 胶束和吐温-85 囊泡（吐温表面活性剂浓度均为1 mmol/L）包载姜黄素的降解曲线。实验结果表明，游离姜黄素在180 min 后降解了约27%，而当使用吐温-60 囊泡、吐温-80 胶束和吐温-85 囊泡包载姜黄素后，姜黄素的降解率分别减少至7.7%、14.1%和2.9%。柯丹等[29]使用表面活性剂胶束包载姜黄素，能够使姜黄素的降解率降低至3.10%～23.7%。相比之下，吐温-85 囊泡表现出更好的包载效果，这可能是由于吐温-85 囊泡的烷基链聚集双分子层能够为姜黄素提供更强的疏水环境。姜黄素在水溶液中的降解过程通常符合一级动力学反应[30]。使用一级动力学方程对姜黄素的降解数据进行拟合，得到游离姜黄素的降解速率常数为0.0018 min−1，而姜黄素在吐温-60 囊泡、吐温-80 胶束和吐温-85 囊泡中的降解速率常数分别为0.00044、0.00082、0.00014 min−1。目前，游离姜黄素的降解过程和降解机理已经有了不少研究，通常认为，由于其酮-烯醇结构容易发生去质子化，因而姜黄素在水环境中容易分解[31]。当姜黄素被吐温聚集体包载后，能够减弱姜黄素的酮-烯醇结构与水的接触，从而使姜黄素表现出更高的稳定性。在3 种吐温聚集体中，姜黄素的稳定性大小顺序为：吐温-85 囊泡>吐温-60 囊泡>吐温-80 胶束。虽然吐温-80比吐温-60 的CMC值低，但是双键的存在会增大吐温-80 烷基链的刚性，这能够减弱吐温-80 的不饱和烷基链和姜黄素的芳香环之间的疏水作用[32]。同时，吐温-80 胶束疏水区域可能会产生部分水合，这也会降低吐温-80 胶束对姜黄素的保护作用。吐温-85 分子中含有3 条烷基链，因此吐温-85 囊泡的双分子层比另外2 种吐温聚集体具有更高疏水性，从而使姜黄素在吐温-85 囊泡中表现出最高的稳定性。
图4 游离姜黄素和吐温聚集体包载姜黄素的降解曲线Fig.4 Degradation curves of free curcumin and curcumin encapsulated by Tween aggregates
2.3 姜黄素与吐温聚集体的结合常数
通过测定不同浓度的姜黄素在3 种吐温聚集体中最大紫外吸收强度的变化，并依据Benesi-Hildebrand方程计算得出姜黄素与3 种吐温聚集体的结合常数[12]。(Kb)
式中：A0为游离姜黄素的最大紫外吸收强度，A为3 种吐温聚集体包载姜黄素的最大紫外吸收强度，c为姜黄素的浓度，a为常数。
根据图5 中1/(A−A0) 与 1/c的线性拟合曲线，姜黄素与吐温-60 囊泡、吐温-80 胶束和吐温-85囊泡的结合常数分别为2.85 ×104、0.99×104、3.06×105L/mol，符合文献报道的姜黄素与表面活性剂的结合常数范围[33]。相比于阴离子表面活性剂琥珀酸二异辛酯磺酸钠[34]，吐温表面活性剂与姜黄素之间的结合常数更大。这是由于阴离子表面活性剂与姜黄素之间存在一定的静电排斥作用，不利于对姜黄素的包载。在3 种吐温聚集体中，姜黄素与吐温-85 囊泡之间具有最大的结合常数，这与姜黄素的稳定性数据一致。吐温-85 囊泡具有最高的疏水性，其双分子层疏水区域能够为姜黄素提供最适宜的包载环境，因而表现出最高的姜黄素包载能力。
图5 吐温-60、吐温-80 和吐温-85 聚集体的1/(A−A0)对1/c 线性拟合曲线Fig.5 1/(A−A0) vs.1/c fitting curves of Tween-60, Tween-80 and Tween-85 aggregates
2.4 吐温聚集体包载姜黄素的紫外-可见吸收和荧光发射光谱
姜黄素是一种高度共轭性分子，其紫外吸收和荧光发射光谱性质对周围环境的变化非常敏感[35-36]。如图6 所示，游离姜黄素的紫外吸收峰较宽，荧光发射峰很弱。当姜黄素包载于吐温聚集体中时，姜黄素的芳香环、双键能够和吐温的烷基链产生疏水相互作用，使姜黄素包载于吐温聚集体的疏水区域。因此，姜黄素从极性较大的水环境变为极性较小的胶束或囊泡环境，其紫外吸收和荧光发射强度显著提高[5]。一方面，低极性的包载环境能够使姜黄素的π- π∗和n- π∗跃迁吸收峰发生分离，所以，吐温聚集体包载的姜黄素在 425 nm 处有显著增强的吸收峰，同时在450 nm 处显示出肩峰[37]；
另一方面，姜黄素的荧光基团在水环境中不稳定，其荧光发射强度较弱[38]，但当姜黄素由水环境转移至极性极小的吐温胶束或囊泡环境后，姜黄素荧光发射峰发生蓝移，由553 nm向499 nm偏移。3 种吐温聚集体中，姜黄素的紫外吸收强度大小顺序为：吐温-85 囊泡>吐温-60 囊泡>吐温-80 胶束。3 种吐温聚集体包载姜黄素的荧光强度也具有相同的大小变化，与姜黄素稳定性和结合常数的结果一致。值得注意的是，姜黄素在吐温-80 胶束中表现出最低的紫外吸收和荧光发射强度，证实双键会增大吐温-80 烷基链的刚性，导致吐温-80 不饱和烷基链与姜黄素的刚性分子结构之间存在错配，因此会使吐温-80 胶束与姜黄素之间的疏水聚集作用降低[39]。在研究表面活性剂体系或表面活性剂与其他分子的相互作用时，一些研究者观察到烷基链不饱和度的增大不利于分子相互聚集，甚至可以抵消烷基链增长带来的分子相互聚集的增强作用[14,17]。然而，吐温-85 分子含有3 条烷基链，烷基链数目的增多能够极大促进吐温-85 分子之间的疏水聚集作用，从而生成具有最强疏水性的吐温-85 囊泡。因此，吐温-85 囊泡对姜黄素具有最高的包载能力，使姜黄素表现出最大的紫外吸收强度和荧光发射强度。
图6 游离姜黄素和吐温聚集体包载姜黄素的紫外吸收光谱（a）和荧光发射光谱（b）Fig.6 UV absorption spectra (a) and fluorescence emission spectra (b) of free curcumin and curcumin encapsulated by Tween aggregates
2.5 姜黄素在吐温聚集体中的包载位置
姜黄素在表面活性剂聚集体中的包载位置与表面活性剂的分子结构有密切关系[40]。1H-NMR 测定结果可以进一步揭示姜黄素在3 种吐温聚集体中的包载位置。表1 和图7 分别示出了吐温-60、吐温-80 和吐温-85 包载姜黄素前后的质子化学位移和1HNMR 图谱。姜黄素的芳香环、双键可以与吐温-60的烷基链产生疏水作用，能够使吐温-60 烷基链中亚甲基上质子b 的化学位移向高场移动。在加入姜黄素后，吐温-60 酯基相邻基团上的质子 e、f 和 g的化学位移也向高场方向移动。这个结果表明姜黄素在吐温-60 囊泡中的包载位置靠近吐温-60 极性头基，能够与吐温-60 的酯基生成氢键[23,41]。当包载姜黄素后，吐温-80 分子中质子b、e、f、g 的化学位移表现与吐温-60 相似的变化。同时，在吐温-80 烷基链双键及其相邻基团中，质子d 和c 也出现了化学位移变化。Karanth 等[32]发现双键会增大吐温-80 烷基链的刚性，造成吐温-80 胶束中烷基链存在弯曲状态，使吐温-80 胶束疏水区域中烷基链排列更加松散、极性更高。相比吐温-60，吐温-80 极性头基附近的质子e 表现出更明显的化学位移变化，这可能是由于姜黄素在吐温-80 胶束中的包载位置更靠近吐温-80 的极性头基，可以产生更强的氢键作用。对于吐温-85，虽然包载姜黄素使其烷基链上质子b、c、d 的化学位移发生变化，但是吐温-85 极性头基附近质子的化学位移并没有变化。因此，姜黄素在吐温-85 囊泡中的包载位置应该更加靠近囊泡双分子层的疏水中心区域而远离吐温-85 的极性头基。综上所述，吐温-60 囊泡和吐温-80 胶束对姜黄素的包载作用力除了疏水作用外还有氢键作用，而吐温-85 囊泡对姜黄素的包载作用力主要为疏水作用。
图7 吐温-60、吐温-80 和吐温-85 包载姜黄素前后的1H-NMR 图谱Fig.7 1H-NMR spectra of Tween-60, Tween-80 and Tween-85 before and after encapsulating curcumin
表1 吐温表面活性剂包载姜黄素前后分子中质子的化学位移Table 1 Chemical shifts of protons of Tween surfactants before and after encapsulating curcumin
烷基链双键和烷基链数目对吐温表面活性剂包载姜黄素具有重要的影响。紫外吸收和荧光发射光谱结果说明姜黄素包载于吐温聚集体的烷基链疏水区域，双键的存在会增大烷基链的刚性，使吐温-80 胶束疏水区域排列更加松散、极性更高，导致吐温-80 胶束包载姜黄素比吐温-60 囊泡包载姜黄素有更低的稳定性、结合常数、紫外吸收和荧光发射强度。具有3 条不饱和烷基链的吐温-85 能够生成大粒径的囊泡结构，为姜黄素提供了最适宜的双分子层疏水区域，对姜黄素具有最好的包载效果。因此通过改变表面活性剂的烷基链结构，可以精细调节表面活性剂聚集体疏水区域的微观结构，使表面活性剂聚集体作为一种高效载体应用于姜黄素等植物多酚活性分子的包载及性质调控。
猜你喜欢囊泡聚集体吐温类胡萝卜素聚集体的研究进展河南工业大学学报（自然科学版）(2021年6期)2022-01-26聚酰胺-胺与十二烷基硫酸钠相互作用及体系的聚集行为对溶液性质的影响*化工科技(2021年5期)2021-11-24虾青素聚集体的研究进展现代食品科技(2021年7期)2021-07-27马克·吐温：辣你没商量小学生学习指导(爆笑校园)(2020年3期)2020-06-05聚二乙炔囊泡的制备及其在医疗检测领域的应用分析化学(2020年2期)2020-02-29马克·吐温的孩童时代疯狂英语·初中天地(2018年6期)2018-11-24人教版高中生物教材中囊泡的作用及功能行使过程理科考试研究·高中(2017年11期)2018-03-06SDS/DTAB/碱金属氯化盐复配囊泡为模板制备PMMA微球湖南师范大学学报·自然科学版(2015年1期)2015-04-07周围型肺癌伴囊泡形成12例的高分辨率CT表现中华肺部疾病杂志(电子版)(2015年5期)2015-02-18水合物聚集体受力分析及临界聚集体粒径的计算石油化工(2014年1期)2014-06-07