LncRNA,TUG1靶向调节miR-21/PTEN轴抑制糖尿病肾病大鼠肾纤维化的作用机制研究

陈生晓,甘艳,邝才花,张蕾,符大天

(1.中国人民解放军联勤保障部队第928医院 肾病风湿科,海南 海口 571159; 2.海南省妇女儿童医学中心药剂科,海南 海口 571159; 3.海南医学院第一附属医院 药学部,海南 海口 570102)

糖尿病肾病(DN)是1型和2型糖尿病(T1DM和T2DM)的一种常见并发症,对公众健康构成相当大的威胁[1-2]。DN是慢性肾病的主要原因,显著增加了糖尿病患者的死亡率。DN的组织形态学异常包括早期肾小球肥大、肾小球基底膜增厚、足细胞耗竭、系膜基质扩张和肾小管损伤[3]。晚期的肾脏改变包括肾小球硬化和肾小管间质纤维化,临床上以肾功能丧失为特征,伴有或不伴有白蛋白尿,并发展为终末期肾病(ESRD)。目前对DN患者的治疗方式主要是严格控制血糖和降压/降脂治疗,这些干预措施并不能阻止患者的肾脏病理变化[4]。因此,迫切需要了解DN进展的基本机制。

长链非编码RNAs(LncRNAs)是一种200 nt长的非编码RNA,不具有蛋白质编码能力。研究表明,LncRNAs在DN的发展中起着至关重要的作用[5]。Liu等[6]研究指出,过表达LncRNA PVT1通过FOXA1途径抑制足细胞损伤和凋亡,从而抑制DN的疾病进程。Zhang等[7]研究指出,LncRNA Rpph1通过与Gal-3的相互作用促进DN的炎症和系膜细胞增殖。LncRNA TUG1是DN的一个生物标志物。LncRNA TUG1位于人类染色体22q12.2上,在多种人类癌症中扮演着致癌基因的作用。有研究[8]指出,LncRNA TUG1通过提高PGC-1α表达从而减轻DN的组织学损害。lncRNA TUG1在DN的进展中发挥了重要作用。研究[9]发现,LncRNA TUG1可以调节线粒体生物能量,并通过调节miR-377靶向过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)来缓解DN的细胞外基质(ECM)积累。然而,lncRNA TUG1在DN的肾脏纤维化中的作用仍不清楚。MicroRNA(miRNA)是一种分子量较小的非编码单链RNA,与靶基因的3′非翻译区(3′UTR)结合,使靶基因降解或阻止其翻译成蛋白质[10]。研究[11]证实,大量的miRNAs例如miR-192、miR-200c、miR-217参与了DN的发病机制。研究表明,miR-21通过靶向磷酸酯酶与张力蛋白同源物(PTEN)基因激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路,导致肾脏纤维化蛋白Col1α2、纤连蛋白异常表达和肾小球异常肥大。本研究应用链脲佐菌素构建DN大鼠模型,旨在探索LncRNA TUG1 在DN大鼠肾纤维化中的作用及其潜在分子机制。

1.1 实验材料

8周龄SPF级SD(Sprague-Dawley)雄性大鼠,体质量220～240 g[由海南药物研究所有限责任公司提供,生产许可证号:SCXK(琼)2020-0007]。肾小球系膜细胞HBZY-1细胞系(美国ATCC细胞库);FBS、RPMI 1640培养基(Gibco,美国);CCK-8溶液(多金多分子技术有限公司,美国马里兰州罗克维尔);RIPA裂解缓冲液(碧云天生物技术有限公司,中国上海);BCA蛋白测定试剂盒、TRIzol试剂、cDNA合成试剂盒、ABI 7500实时PCR系统(赛默飞世尔科技公司,美国);增强型化学发光试剂(默克公司,德国);GAPDH(Abcam公司,英国);SYBR-Green PCR试剂盒(东洋纺生物科技有限公司, 日本)。本研究经中国人民解放军联勤保障部队第928医院伦理委员会批准。

1.2 细胞培养

含有20% FBS的RPMI 1640培养基培养HBZY-1细胞,应用30 mmol·L-1葡萄糖构建HBZY-1细胞系的诱导模型。

1.3 DN动物模型构建

动物饲养环境参照中华人民共和国国标GB14925-2010,温度20～26 ℃(日温差≤4 ℃),相对湿度40%～70%,人工照明,12 h明暗交替。大鼠动物模型构建如文献[12]所示。将链脲佐菌素(STZ)溶解在0.1 mol·L-1柠檬酸缓冲液中,大鼠腹腔注射60 mg·kg-1STZ,1次·d-1,连续5 d,建立DN大鼠模型。血糖水平超过16.5 mmol·L-1被确定为成功的DN模型。将DN大鼠分为LncRNA TUG1过表达组和模型对照组(LncRNA-NC组)两组。LncRNA TUG1过表达组大鼠尾静脉注射200 μl慢病毒LV-TUG1;LncRNA-NC组大鼠尾静脉注射200 μl的LV-NC。

1.4 CCK-8实验方法

使用CCK-8实验检测各种处理方法对细胞活力的影响。对数生长期的HBZY-1细胞以5×104个·(100 μl)-1的密度接种至96孔板中,在含有5% CO2的培养箱中37 ℃培养24 h,吸去培养基后加入10 μl CCK-8溶液孵育4 h,使用酶标仪在450 nm测定每组细胞的吸光度,并使用Graphpad prism软件绘制细胞增殖曲线。

1.5 Western blot试验方法

细胞和组织样本在RIPA裂解缓冲液中裂解,并使用BCA蛋白测定试剂盒检测蛋白浓度。30 μg·孔-1的总蛋白上样后应用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分离,并应用湿转法转移至PVDF膜上。在室温下用5%的BSA溶液封闭1 h,加入一抗在4 ℃下孵育过夜。将膜与相应的山羊抗兔二抗在室温下孵育2 h,并通过化学发光法进行检测。使用增强型化学发光试剂对蛋白质进行可视化,GAPDH作为内部参照。

1.6 实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)试验方法

通过RT-qPCR测定细胞和组织样本中的LncRNA TUG1、miR-21以及纤维化相关指标。使用TRIzol试剂从组织和细胞中提取总RNA并逆转为cDNA,应用SYBR-Green PCR试剂盒在ABI 7500实时PCR系统进行qPCR。热循环条件如下:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性5 s,60 ℃退火30 s(40个循环), 2-ΔΔct法计算实验结果。引物见表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer Sequence

1.7 苏木精-伊红(HE)染色

HE染色评估肾脏组织的形态变化。将肾组织固定在4%多聚甲醛中,石蜡包埋后按照标准程序切成5 μm切片进行HE染色,在显微镜下对切片的5个随机区域进行拍照。

1.8 双荧光素酶报告基因实验方法

将WT或MUT LncRNA TUG1结合位点亚克隆到pCDNA3.1质粒。HBZY-1细胞在转染前24 h在24孔板中进行电转,miR-21 mimic、miR-221mimic和相应的对照物与10 μg的pCDNA3.1-WT-TUG1或pCDNA3.1-MUT-TUG1共同转染。双荧光素酶报告基因测定系统检测荧光素酶活性。

1.9 统计学处理

采用统计软件SPSS 20.0对数据进行分析,计数资料以均数±标准差表示,两组间的比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。多组间的比较将各项指标数据按下面的程序分析:用Levene’s检验方差齐性,如果没有统计学意义(P>0.05),用单因素方差分析(ANOVA)进行统计分析,如果 ANOVA 有统计学意义(P<0.05),用 LSD法进行全面的比较;如果方差不齐(P<0.05),则用Dunnett’s T3检验进行统计分析。

2.1 动物模型构建以及DN大鼠肾脏组织中LncRNA TUG1表达水平检测

与对照组相比,DN模型大鼠的血糖、血肌酐、尿白蛋白水平均显著上升(P<0.05),DN大鼠动物模型构建成功。RT-qPCR实验结果显示,与对照组相比,DN模型大鼠肾脏组织中LncRNA TUG1表达水平显著降低(P<0.05),如图1A所示。LncRNA表达谱芯片实验结果显示,DN大鼠肾脏组织中共有30个异常表达的LncRNA,其中LncRNA TUG1是最显著上调的LncRNA,如图1B所示。HE染色实验结果显示,与对照组相比,模型组大鼠肾脏组织形态学显著改变,肾小球形状不规则、体积增大,肾小球内细胞排列紊乱,肾小囊结构模糊,如图1C所示。

a与对照组相比,P<0.05,n=10A.STZ处理8周后DN大鼠血糖、血肌酐、尿白蛋白、LncRNA TUG1表达水平检测;B.热图以及火山图展示DN大鼠肾脏组织中LncRNA表达谱的差异;C.HE染色检测大鼠肾脏组织形态学图1 DN大鼠模型构建验证以及LncRNA TUG1表达水平检测A.Detection of blood glucose, serum creatinine, urinary albumin and LncRNA TUG1 expression in DN rats after 8 weeks of treatment with streptozotocin; B.Heat map and volcano map show the difference of LncRNA expression profile in kidney tissue of DN rats; C.HE staining used to detect the histomorphology of rat kidneyFig 1 Verification of DN rat model construction and detection of LncRNA TUG1 expression

2.2 过表达LncRNA TUG1对DN大鼠肾脏组织纤维化的影响

RT-qPCR实验结果显示,与LncRNA-NC组相比,LncRNA TUG1过表达组大鼠肾脏组织中LncRNA TUG1表达水平上升,差异具有统计学意义(P<0.05),如图2A所示。过表达LncRNA TUG1能够显著降低DN大鼠模型的尿白蛋白含量(P<0.05),如图2B所示。RT-qPCR实验结果显示,过表达LncRNA TUG1降低了肾脏组织中纤维连接蛋白(FN)、人Ⅳ型胶原(Col-4)和转化生长因子β1(TGFβ1)mRNA表达水平(P<0.05),如图2C所示。HE染色结果显示,与LncRNA-NC组相比,LncRNA TUG1过表达组大鼠肾脏组织形态学显著改善,具体表现为肾小球内细胞较为整齐,肾小囊结构完整,轮廓清晰,如图2D所示。Western blot实验结果显示,过表达LncRNA TUG1降低了肾脏组织中FN、Col-4和TGFβ1蛋白表达水平(P<0.05),如图2E所示。过表达LncRNA TUG1能够显著降低DN大鼠肾脏组织纤维化水平,抑制DN的病理进程。

a 与LncRNA-NC组比较,P<0.05,n=10A.RT-qPCR实验检测LncRNA-NC组与LncRNA TUG1过表达组大鼠肾脏组织中LncRNA TUG1表达差异; B.LncRNA-NC组和LncRNA TUG1过表达组大鼠尿蛋白检测; C.RT-qPCR检测过表达LncRNA TUG1对肾脏组织中FN、Col-4和TGFβ1 mRNA表达水平的影响; D.HE染色检测LncRNA-NC组与LncRNA TUG1过表达组大鼠组织学差异; E.Western blot检测过表达LncRNA TUG1对肾脏组织中FN、Col-4和TGFβ1蛋白表达水平的影响图2 过表达LncRNA TUG1对DN大鼠肾脏组织纤维化的影响A.Difference of LncRNA TUG1 expression in kidney tissues of rats in LncRNA-NC group and LncRNA TUG1 overexpression group detect by RT-qPCR; B.Detection of urine protein of rats in LncRNA-NC group and LncRNA TUG1 overexpression group; C.The effect of overexpression LncRNA TUG1 on FN, Col-4 and TGFβ1 mRNA expression in kidney tissue detect by RT-qPCR; D.Histological differences of rats in the LncRNA-NC group and LncRNA TUG1 overexpression group detected by HE staining; E. The effect of overexpression of LncRNA TUG1 on FN, Col-4 and TGF β1 protein expression in kidney tissue detect by Western blotFig 2 Effects of overexpression of LncRNA TUG1 on renal fibrosis in DN rats

与LncRNA-NC组相比,过表达LncRNA TUG1能够显著下调miR-21表达水平(P<0.05),促进PTEN蛋白表达(P<0.05),并显著降低磷酸化磷脂肌醇3激酶(p-PI3K)及磷酸化蛋白激酶(p-Akt)蛋白表达水平(P<0.05),如图3所示。

a与LncRNA-NC组相比,P<0.05A.RT-qPCR实验检测大鼠肾脏组织中miR-21表达水平;B. Western blot实验检测大鼠肾脏组织中PTEN、PI3K、Akt蛋白表达水平图3 过表达LncRNA TUG1对PI3K/Akt信号通路的影响A.The expression level of miR-21 in rat kidney tissue detected by RT-qPCR;B.The expression level of PTEN, PI3K and Akt proteins in rats kidney tissue detected by Western blotFig 3 Effects of overexpression of LncRNA TUG1 on PI3K/Akt signaling pathway

2.3 LncRNA TUG1与miR-21的相互作用

LncBase(https:∥diana.e-ce.uth.gr/lncbasev3)预测发现miR-21是LncRNA TUG1的潜在作用靶点。图4A显示了LncRNA TUG1与miR-21的直接结合情况。Pearson相关分析指出,在DN大鼠肾脏组织中,LncRNA TUG1表达水平与miR-21表达水平呈负相关,与PTEN mRNA表达水平呈正相关,如图4B、C所示。双荧光素酶报告基因实验结果显示,在肾小球膜细胞HBZY-1细胞系中,miR-21抑制了LncRNA TUG1野生型报告基因的荧光素酶活性,然而突变型报告基因的荧光素酶活性未被miR-21抑制,如图4D所示。

a P<0.05A.LncBase生物信息软件预测LncRNA TUG1与miR-21的直接结合情况; B.LncRNA TUG1表达水平与PTEN mRNA的相关性; C.LncRNA TUG1表达水平与miR-21的相关性;D.双荧光素酶报告基因实验检测LncRNA TUG1与miR-21的直接作用关系图4 LncRNA TUG1与miR-21的相互作用A.LncBase bioinformatics software predicts the direct combination of LncRNA TUG1 and miR-21; B.The correlation between LncRNA TUG1 expression level and PTEN mRNA; C.The correlation between LncRNA TUG1 expression level and miR-21; D.The direct interaction between LncRNA TUG1 and miR-21 detected by fluorescein reporter experimentFig 4 Interaction between LncRNA TUG1 and miR-21

2.4 过表达LncRNA TUG1对HBZY-1细胞增殖及纤维化蛋白表达水平的影响

RT-qPCR实验结果显示,在高糖诱导下的HBZY-1细胞中,LncRNA TUG1表达水平显著升高(P<0.05),miR-21表达水平显著降低(P<0.05),纤维化相关指标FN、Col-4和TGFβ1表达水平显著升高(P<0.05)。过表达LncRNA TUG1能够显著上调miR-21表达水平(P<0.05),抑制FN、Col-4和TGFβ1 mRNA表达水平(P<0.05),如图5A所示。

a与对照组相比,P<0.05A.RT-qPCR检测不同处理方式对HBZY-1细胞LncRNA TUG1、miR-21、FN、Col-4和TGFβ1表达的影响;B.CCK-8实验检测不同处理方法对HBZY-1细胞的增殖能力的影响图5 过表达LncRNA TUG1对HBZY-1细胞增殖以及纤维化蛋白表达的影响A.The effects of different treatment methods on LncRNA TUG1, miR-21, FN, Col-4 and TGFβ1 in HBZY-1 cells detect by RT-qPCR;B.The effects of different treatment methods on the proliferation of HBZY-1 cells detect by CCK-8 testFig 5 Effects of overexpression of LncRNA TUG1 on the proliferation of HBZY-1 cells and the expression of fibrosis protein

CCK-8实验结果显示,与对照组相比,高糖诱导下的HBZY-1细胞的增殖能力显著升高(P<0.05)。与高糖诱导组相比,过表达LncRNA TUG1能够显著抑制HBZY-1细胞的增殖能力(P<0.05),如图5B所示。

2.5 miR-21 mimic对过表达LncRNA TUG1的抗增殖以及抗纤维化作用的影响

RT-qPCR实验结果显示,与过表达LncRNA TUG1+miR-con组相比,过表达LncRNA TUG1+miR-21 mimic组细胞中miR-21表达水平显著升高(P<0.05),FN、Col-4和TGFβ1 mRNA表达水平显著升高(P<0.05),如图6A所示。CCK-8实验结果显示,与过表达LncRNA TUG1+miR-con组相比,过表达LncRNA TUG1+miR-21 mimic组细胞增殖能力显著升高(P<0.05),如图6B所示。结果显示miR-21 mimic抑制过表达LncRNA TUG1的抗增殖以及抗纤维化效应。Western blot实验结果表明,与过表达LncRNA TUG1+miR-con组相比,过表达LncRNA TUG1+miR-21 mimic组细胞中PTEN蛋白表达水平显著降低(P<0.05),而p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达水平显著升高(P<0.05),如图6C所示。

a与LncRNA TUG1+miR-21 mimic组相比,P<0.05A.RT-qPCR检测不同处理方式对HBZY-1细胞miR-21、FN、Col-4和TGFβ1表达水平的影响;B.CCK-8实验检测不同处理方法对HBZY-1细胞增殖能力的影响;C.Western blot实验检测不同处理方法对HBZY-1细胞中PTEN、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达水平的影响图6 miR-21 mimic对过表达LncRNA TUG1的抗增殖以及抗纤维化作用的影响A.The effects of different treatment methods on miR-21, FN, Col-4 and TGF β 1 in HBZY-1 cells detected by RT-qPCR; B. The effects of different treatment methods on the proliferation of HBZY-1 cells detected by CCK-8 test; C.The effects of different treatment methods on the expression levels of PTEN, p-PI3K/PI3K and p-Akt/Akt proteins in HBZY-1 cells detected by Western blotFig 6 Effects of miR-21 mimic on anti proliferation and anti fibrosis of overexpression LncRNA TUG1

越来越多的研究表明,lncRNA-miRNA-mRNA网络是转录后基因调控的核心调节机制。例如,LncRNA H19通过作为miR-199a-5p的分子海绵,上调VEGF A以增强间充质干细胞的生存和血管生成能力[13]。LncRNANEAT1通过靶向miR-132来调节胶质瘤细胞中的SOX2表达,从而抑制细胞侵袭[14]。此外,miRNAs是DN发展过程中的重要调节因子。Liu等[15]研究指出,BMP-7通过调节miR-21/Smad7信号传导抑制DN的肾脏纤维化。Zhou等[16]研究结果显示,miR-21的下调通过靶向TIMP3抑制了STZ诱导的DN大鼠疾病进程,并且在高糖处理的足细胞中抑制其凋亡。Guo[17]研究结果显示,miR-21通过PTEN/Akt信号通路调控纳米二氧化硅诱导的DN大鼠肾脏纤维化。本研究生物信息学分析结果显示,MiR-21是LncRNA TUG1的一个潜在靶点。双荧光素酶报告基因实验进一步指出,LncRNA TUG1以序列特异的方式与miR-21发生直接作用。Wang等[18]研究结果指出,LncRNA TUG1通过抑制miR-21促进TIMP3的表达来改善DN。Li等[19]研究结果显示,LncRNA TUG1通过调节miRNA-21/PTEN轴促进血管平滑肌细胞的增殖和动脉硬化。

FN、Col-4和TGFβ1是纤维化的常见指标,TGF-β1为强致纤维化因子,与肾纤维化密切相关,Smads为TGF-β1下游靶分子。周靖等[20]发现,下调大鼠肾组织TGF-β1可使Smads蛋白的磷酸化水平降低,从而改善大鼠肾脏纤维化。本研究通过CCK8和RT-qPCR实验探讨LncRNA TUG1对肾小球系膜细胞HBZY-1的增殖以及纤维化的影响。结果显示,过表达LncRNA TUG1显著抑制了HBZY-1细胞的增殖以及纤维化指标FN、Col-4和TGFβ1的表达。同时,LncRNA TUG1和PTEN相关研究结果显示,LncRNA TUG1和PTEN在invivo水平的表达呈正相关。PI3K是一种细胞内磷脂酰肌醇激酶,具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性。Akt是一种蛋白激酶,也叫蛋白激酶B(PKB)。PI3K首先被酪氨酸激酶激活,将磷脂酰肌醇4,5-二磷酸酯(PIP2)转化为磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸酯(PIP3),促进Akt在质膜上的积累。然后,Akt的Thr308在3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)的协助下被磷酸化[21]。最后,被激活的Akt可以在多种生理过程中发挥其生物功能,包括细胞增殖、分化、凋亡、迁移和代谢。大量的研究已经探索了DN肾纤维化与PI3K/Akt信号通路的相关关系。Chen等[22]研究指出,PI3K/Akt的激活参与了高糖条件下诱发的肾小管间质纤维化。Li等[23]发现在HK2细胞中敲除SHIP导致PI3K/Akt通路的激活,随后上调了TGF-β1、α-SMA和collagen type 3的表达。此外,Zhu等[24]还发现,在STZ诱导的糖尿病小鼠和体外人类肾小管上皮细胞中,高糖条件下磷酸化Akt(Ser 473)、磷酸化Akt(Thr 308)、CTGF和α-SMA的水平都有所提高,应用PI3K/Akt信号转导途径的抑制剂LY294002能够显著抑制CTGF、fibronectin和胶原蛋白的含量。本研究结果显示,过表达LncRNA TUG1通过抑制miR-21表达上调PTEN表达,并可能通过抑制PI3K/Akt信号通路从而抑制DN大鼠肾纤维化。

综上所示,我们的研究指出LncRNA TUG1是DN疾病进程中的一个重要的调控因子。LncRNA TUG1通过分子海绵作用调控miR-21,随后调节PTEN的表达来抑制DN的肾脏纤维化。这个LncRNA TUG1/miR-21/PTEN途径可能在DN的发展中扮演重要的角色,并可能成为DN的一个治疗靶点。

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