张 爽，刘敏芳，刘 帆，马晓艳
（浙江方圆检测集团股份有限公司，浙江 杭州 310018）
可食用着色剂是一类能赋予食品色泽或改善食品色泽的物质，目前我国常用的食品着色剂种类繁多，根据其合成途径可分为天然着色剂和合成着色剂两类，按其溶解性质又可分为水溶性和脂溶性着色剂[1]。合成着色剂着色艳丽、价格低廉，被广泛使用于食品加工行业，然而合成着色剂主要以苯胺染料为原料，经过磺化、卤化、偶氮化等有机反应合成，对人体具有一定的危害作用，长期摄入可致癌、致畸[2-3]。因此，我国对相关合成着色剂制定了严格的管控标准，其中GB 2760—2014 规定靛蓝、新红、亮蓝、诱惑红、柠檬黄、日落黄、胭脂红、苋菜红是允许在食品中限量使用的，并明确规定了其最大使用限量[4]。
目前，合成着色剂的检测方法主要有紫外分光光度法[5]、薄层色谱法[6-7]、毛细管电泳法[8]、高效液相色谱法[9-10]、高效液相色谱串联质谱法[11-12]。其中，紫外分光光度法在混合着色剂的检测方面存在互相干扰的问题，薄层色谱法和毛细管电泳法灵敏度低且重现性较差，在合成色素的准确定性和定量方面存在一定局限性。高效液相色谱法能够有效分离各种合成着色剂，其中GB 5009.141—2016 和GB 5009.35—2016 均采用了高效液相色谱法检测合成着色剂[13-14]，现行国标GB 5009.35—2016 中只能同时测定7 种合成着色剂，难以满足市场监管要求。串联质谱法具有快速、灵敏、高通量和选择性强等特点，其在分析物精准定性与定量上具有较大优势，是非常有效的合成着色剂检测技术。
1.1 仪器与试剂
超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪，Waters corporation 公司产品；
Thermo Scientific 型离心机，赛默飞世尔科技公司产品；
旋蒸仪，东京理化器械株式会社产品；
GL Sciences WondaSil C18型色谱柱（4.6 mm I.D.×250 mm，5 μm）、甲醇、乙酸铵为色谱纯，乙醇、氨水为分析纯。
标准物质：靛蓝（indigotine，纯度99.0%）、新红（new red，纯度92.0%）、亮蓝（brilliant blue FCF，纯度83.0%）、诱惑红（allura red AC，纯度80.0%）、柠檬黄（tartrazine，纯度90.0%）、日落黄（sunset yellow，纯度87.0%）、苋菜红（amaranth，纯度81.0%）、胭脂红（ponceau 4RC，纯度75.0%），标准样品均为坛墨质检科技股份有限公司提供。
标准溶液的配制：称取靛蓝、新红、亮蓝、诱惑红、柠檬黄、日落黄、胭脂红、苋菜红标准品（精确到0.000 1 g） 配制成1 mg/mL 的标准溶液，备用。根据实际需要配成混标溶液，使用时再将混标溶液稀释成梯度标准溶液。
1.2 色谱-质谱条件
利用GL Sciences WondaSil C18（4.6 mm I.D.×250 mm，5 μm） 柱进行分离。流动相：A 相，甲醇；
B 相，20 mmol/ L 乙酸铵水溶液。柱温35 ℃，样品温度25 ℃，进样体积5 μL，流速1.0 mL/min。液相色谱流出液分流后进质谱检测。
梯度洗脱程序见表1。
表1 梯度洗脱程序
离子化模式：电喷雾离子源；
雾化气流速为1.50 L/min；
分析模式：负离子模式；
干燥气流速10 L/min；
曲形脱溶剂管（CDL） 温度200 ℃；
检测器电压1.70 kV；
加热模块温度200 ℃；
离子源电压4.5 kV；
质谱采集范围（m/z） 200~600；
离子累积时间100 ms。
1.3 样品预处理
将样品搅拌均匀制成肉糜后，精确称取10 g 样品于50 mL 比色管中，加入乙醇-氨水溶液30 mL，将比色管置于超声波清洗仪中超声提取30 min，用乙醇- 氨- 水溶液（7∶2∶1，V/V） 定容至刻度。摇匀，倒入离心管中进行离心（以转速6 000 r/min 离心10 min），将上清液倒入烧杯中，加热使乙醇和氨蒸发。待样液少于10 mL 时，冷却至温室。加入柠檬酸溶液，调节pH 值到4.0 左右，再加入聚酰胺，搅均后倒入G3 漏斗中，进行抽滤，分别用pH 值为4.0，温度为60 ℃的水、甲醇-甲酸（V/V，6∶4）、热蒸馏水各冲洗3 次，最后再用5 mL 乙醇-氨水-水（7∶2∶1，V/V） 溶液，解析3~5 次。收集全部解析液，用乙酸中和，蒸干，最后用流动相定容到5.0 mL。定容后经0.22 μm 滤膜过滤，滤液进行上机分析。
2.1 提取方法选择
8 种可食用着色剂均为水溶性着色剂，可直接用水进行提取。由于肉制品中脂肪和蛋白含量较高，可用乙醇进行分离，故选用乙醇的水溶液进行提取效果较好，同时再加入部分氨水，会起到更好的提取着色剂的效果，因此试验选用氨水-乙醇的水溶液来提取样品。
2.2 方法学验证
2.2.1 标准曲线与精密度
用超纯水配制8 种可食用着色剂的混合标准溶液，然后用流动相将混合标准溶液稀释成一系列质量浓度，以峰面积和质量浓度绘制标准曲线。
8 种着色剂的保留时间、监测离子、线性回归方程、线性范围、相关系数（R2） 及相对标准标准偏差见表2。
表2 8 种着色剂的保留时间、监测离子、线性方程、线性范围、相关系数及相对标准偏差
2.2.2 检出限、定量限、回收率的确定
分别在空白样品中添加3 种不同水平的混合标准溶液，按上述预处理方法进行前处理。
肉制品中8 种可食用着色剂的回收率、检出限（LOD，S/N=3）、定量限（LOQ，S/N=10） 及相对标准偏差见表3。
表3 肉制品中8 种可食用着色剂的回收率、检出限、定量限及相对标准偏差
由表3 可知，在低、中、高3 种加标水平，8 种可食用着色剂的回收率分别为50.3%~89.1%，52.6%~103.2%，67.0%~91.6%；
相对标准偏差分别为5.6%~9.0%，5.4%~8.9%，5.6%~8.6%，符合日常检测的要求。
2.3 样品确证
由于高效液相色谱法存在对目标峰定性不准确的缺点，容易产生误判。而利用高效液相色谱串联质谱技术对目标化合物进行定量、定性的方法，造成误判的可能将大大减小。以日落黄为例。
日落黄的色谱图见图1，日落黄的提取离子流图见图2。
图1 日落黄的色谱图
图2 日落黄的提取离子流图
首先，可通过二极管阵列检测器与离子阱飞行时间质谱的保留时间进行定性。在色谱图上显示的日落黄的保留时间为23.4 min，在提取离子流图上显示的日落黄的保留时间为23.5 min，保留时间几乎相同，有细微差别是正常的，这是因为目标物是先经过二极管阵列检测器进行检测，然后才进入到质谱被检测到。所以这样不会造成错找目标化合物的色谱峰。其次，可通过精确质量数进行定性。
日落黄的三级质谱图见图3。
图3 日落黄的三级质谱图
建立了利用液相色谱质谱法测定肉制品中可能滥用的8 种可食用着色剂的分析方法。LCMS-IT-TOF方法的检出限如下：新红检出限0.15 mg/kg，定量限0.5 mg/kg；
靛蓝、诱惑红、柠檬黄的检出限1.50 mg/kg，定量限5.0 mg/kg；
亮蓝、日落黄检出限0.75mg/kg，定量2.5 mg/kg；
胭脂红、苋菜红检出限0.30 mg/kg，定量限1.0 mg/kg。液相方法的定量限如下：靛蓝定量限0.40 mg/kg，亮蓝定量限1.04 mg/kg，柠檬黄定量限0.16 mg/kg，苋菜红定量限0.24 mg/kg，日落黄定量限0.28 mg/kg，胭脂红和诱惑红定量限0.32 mg/kg，新红定量限0.20 mg/kg。8 种可食用着色剂的线性关系较好，相关系数R2＞0.99。相对标准偏差＜10%，3 个水平的加标回收率为50.3%~103.2%，高效液相色谱的加标回收率为70.6%~99.5%。将该方法应用于实际样品的检测，并通过离子阱-飞行时间质谱的精确质量数、快速简便、多级质谱分析、专属性强、定性准确的优势对阳性样品进行了确证，能够有效地避免假阳性结果的出现，可满足肉制品中的合成食用色素的分析及确证要求，在食品安全控制中具有很好的实用性。
因此，利用高效液相色谱对目标化合物进行定量，离子阱- 飞行时间质谱进行定性的方法简便、快速且可同时对阳性样品进行确证，大大节约了时间及提升了风险监测的能力。
建立了利用液相色谱-离子阱-飞行时间质谱法，测定肉制品中可能滥用的8 种可食用着色剂的分析方法，经方法学验证各指标均满足日常检测要求。与现有的检测标准相比，该方法增加了所检测的合成着色剂种类。同时，由于利用高效液相色谱对目标化合物进行定量，利用离子阱-飞行时间质谱进行定性，该方法能够准确快速地对阳性样品进行确证，大大节约了时间及提升了风险监测的能力。将该方法应用于实际样品的检测，能够有效地避免假阳性结果的出现，可满足肉制品中的合成食用色素的分析及确证要求，在食品安全控制中具有很好的实用性。
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