姚楚玄,张 磊,秘彩莉,周 硕,董福双,刘永伟,杨 帆,焦 博,柴建芳
(1.河北省农林科学院生物技术与食品科学研究所/河北省植物转基因中心,河北石家庄 050051; 2.河北师范大学生命科学学院,河北石家庄 050024)
小麦1B/1R易位系由于1R染色体短臂(1RS)上携带有抗病、高产、广适性等优良基因[1-2],在中国已得到广泛应用[3-5],但其加工品质不佳,主要体现在面筋强度低、耐揉性差和面团发粘,因此不适合加工优质面包和优质面条[6-7]。原因可能是1RS携带的黑麦碱基因编码的ω-黑麦碱和γ-黑麦碱[8]均为单体蛋白,其中ω-黑麦碱极易溶于水。
小麦高分子量麦谷蛋白亚基(high molecular weight glutenin subunit, HMW-GS)分别由1A、1B和1D染色体长臂上的Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1位点编码。研究表明,Glu-D1位点编码的5+10优质亚基取代等位变异2+12亚基后,可在一定程度上提高1B/1R易位系的加工品质[9-10]。但仅靠导入5+10优质亚基提高小麦加工品质的幅度有限。Glu-B1位点编码的超表达7OE亚基是另一个重要的优质亚基,该亚基在国外应用相对较多[11],在国内强筋春小麦育种中也有应用[12],但在改善小麦1B/1R易位系品质方面尚未见报道。
麦谷蛋白溶胀指数(swelling index of glutenin, SIG)作为反映小麦品质的一个参数,测定时仅需要少量的面粉或全粉[13-14]。乳酸-SDS溶剂保持力(lactic acid-sodium dodecyl sulfate solvent retention capacity,LA-SDS SRC)是软质小麦品质的特有参数,其反映软质小麦的优劣,测定时面粉或全粉用量较多,但重复性较好,适合对早代材料进行品质预测[15]。SDS沉降值能体现小麦烘烤品质的好坏,测定时需要样品量也较少[16]。本研究选用小麦1B/1R易位系品种科农199为母本,与含有7OE亚基的强筋春小麦品种津强6号杂交,从后代中筛选出黑麦碱基因与7OE亚基基因聚合在同一条染色体上的1B/1R易位系材料,然后通过SIG、LA-SDS SRC和SDS沉降值测定,初步了解这种聚合材料的品质情况,以期为今后更好利用1B/1R易位系提供技术支撑。
1.1 供试材料及种植
供试材料包括科农199(母本)、津强6号(父本)及其杂交后代。其中,科农199为中筋冬小麦品种,含1B/1R易位,其HMW-GS组成为1/7+9/2+12;津强6号为强筋春小麦品种,不含1B/1R易位,其HMW-GS组成为1/7OE+8*/5+10;杂交后代选用7+9和7OE+8*亚基基因之间发生替换的F4代单株及其后代。F4代种子播种于玻璃温室,温度控制在18～25℃,每天光照16 h;F5代种子播种于大田,种成株行,常规大田管理。
1.2 DNA提取及PCR扩增
用天根生化科技有限公司(北京)生产的植物基因组DNA小量提取试剂盒提取小麦叶片的基因组DNA,使用北京GenStar公司(北京)生产的StarMix,在BIO-RAD S1000TMPCR仪中进行PCR扩增。杂交后代黑麦碱基因的纯合性检测按照Chai等[17]的方法进行;5亚基基因的纯合性检测按照Ishikawa等[18]的方法进行;7OE亚基基因的纯合性检测使用Bx7OE标记[19],9亚基基因的纯合性检测使用By9标记[20]。选用位于1BL的4个SSR标记Xgwm124、Xgwm259、Xgwm268和Xgwm582[21-22]检测7OE亚基发生聚合的位点。所用的标记信息见表1。
表1 本研究所用的标记引物信息Table 1 Primers of markers used in this study
1.3 麦谷蛋白溶胀指数(SIG)的测定
用FOSS旋风磨(带有1 mm的不锈钢滤网)将小麦籽粒磨成全粉,按照Wang等[13]的方法进行SIG测定,略有改动。具体步骤:称取40 mg全粉置于称重的2 mL离心管中,加入0.6 mL蒸馏水,在旋涡震荡器中(1 400 r·min-1) 水化20 min,然后再加入0.6 mL SDS-乳酸溶液[2% SDS溶液∶乳酸储液(85%乳酸用蒸馏水稀释8倍后加热回流6 h) = 48∶1]混合5 min,使其溶胀,然后300 g离心5 min后,去掉上清液,离心管再300 g离心2 min后,倒置20 min,然后称取整个离心管的重量。离心管中残留物质的重量与面粉重量的比值即为SIG值。每个样品重复测定3次。
1.4 微量SDS沉降值的测定
按照Dick等[16]的方法进行SDS沉降值测定,略有改动。具体步骤:每个样品称取0.5 g小麦全粉,置于10 mL具塞刻度试管中,然后加入2 mL溴酚兰水溶液(10 mg·L-1),用涡旋震荡器混合20 s,静置5 min,再涡旋震荡混合10 s,再静置5 min后,立即向混合后的样品中加入6 mL SDS-乳酸混合溶液,上下颠倒10次后,迅速竖立于小麦SDS沉淀值测定仪试管架上放置10 min,快速准确读取沉降值。每个样品重复测试3次。
1.5 乳酸-SDS溶剂保持力(LA-SDS SRC)的测定
采用Seabourn等[15]的方法测定小麦全粉的LA-SDS SRC。具体步骤:取25 mL 85%的乳酸溶液加入至200 mL蒸馏水中,将该储液加热回流6 h,以减少乳酸分子的聚集趋势,然后将乳酸储液与蒸馏水按1∶19 的比例混合为“乳酸工作液”。称量1.0 g小麦全粉,放入提前称重的50 mL离心管中,加入5 mL乳酸工作液,用涡旋震荡仪混合6 s,然后加入20 mL 1.25% 的SDS溶液,再次用涡旋震荡仪混合6 s。然后将离心管在摇床上摇动4 min (300 r·min-1,23 ℃),3 200 g离心2 min后,去掉上清液,倒置在吸水纸上,静置20 min后称取整个离心管的重量。每个样品重复测定3次。计算公式如下:SRC=[(沉降物重量/面粉重量)×86/(100-面粉含水量)-1]×100%。面粉含水量采用HM-105L卤素水份分析仪进行测定。
1.6 统计分析
用DPS 9.01软件对测定结果进行方差分析和差异显著性比较(Duncan法)。
2.1 聚合7OE亚基1B/1R易位系材料创制结果
1B/1R易位系中筋小麦品种科农199与非1B/1R易位系强筋小麦品种津强6号杂交,从F2代开始对农艺性状表现优良的后代进行HMW-GS组成检测,发现30个F3代植株中,有3个植株黑麦碱基因纯合而7OE亚基基因杂合,1个植株7OE亚基基因纯合而黑麦碱基因杂合,说明这些植株中发生了7OE亚基基因与黑麦碱基因之间的聚合。为获得纯合聚合体,进一步对黑麦碱基因纯合而7OE亚基基因杂合植株的F4代分离群体进行PCR检测,发现被检测的44个植株中,7OE亚基基因与黑麦碱基因均纯合的聚合植株7株,杂合聚合植株27株,纯合非聚合植株10株。图1展示了3个纯合聚合植株和3个非聚合植株及其亲本中黑麦碱基因以及Glu-B1位点7OE和9亚基基因的PCR检测结果。由于这6个后代植株的黑麦碱基因已经纯合,所以只扩出了1条1 076 bp的特异条带(图1A)。在Glu-B1位点,含有7OE亚基的3个聚合植株和亲本津强6号扩增出7OE亚基基因特异的844 bp条带(图1B);而含有9亚基的3个非聚合植株和亲本科农199扩增出9亚基基因特异的662 bp条带(图1C),3个聚合植株没有扩出662 bp的特异条带,说明聚合植株中7OE和8*亚基仍连锁在一起。在Glu-D1位点,这3个纯合聚合植株和3个非聚合植株只扩增出了5亚基基因特异的320 bp条带,而没有扩出2亚基基因特异的361 bp条带(图2),说明聚合植株和非聚合植株在Glu-D1位点均携带5亚基基因。在Glu-A1位点,由于两个亲本均携带1亚基,所以聚合植株和非聚合植株在该位点仍均携带1亚基基因。综合3个亚基基因的PCR检测结果,说明这6个F4代植株除了在Glu-B1位点有差异外,在Glu-A1和Glu-D1位点上没有差异。
A:黑麦碱基因的检测结果;B:Glu-B1位点7OE亚基基因的检测结果;C:Glu-B1位点9亚基基因的检测结果。M:DL2000;H:阴性对照(H2O);P1:津强6号(父本);P2:科农199(母本);1～3:7OE亚基基因与黑麦碱基因未聚合植株;4～6:7OE亚基基因与黑麦碱基因聚合植株,图2和图3同。A: PCR results of secalin gene; B: PCR results of 7OE subunit gene at Glu-B1 locus; C: PCR results of 9 subunit gene at Glu-B1 locus. M: DL2000; H: Negative control(H2O); P1: Jinqiang 6(male parent); P2: Kenong 199(female parent); 1-3: 1B/1R translocation plants without pyramiding 7OE subunit; 4-6: 1B/1R translocation plants with pyramiding 7OE subunit. The same in figures 2 and 3.图1 F4代部分聚合和未聚合植株中黑麦碱基因和Glu-B1位点7OE亚基基因的PCR检测Fig.1 PCR result of secalin gene and 7OE subunit gene at Glu-B1 locus of some plants with and without pyramiding in F4 generation
图2 F4代部分聚合和未聚合植株中Glu-D1位点5亚基基因的PCR检测Fig.2 PCR result of 5 subunit gene at Glu-D1 locus of some plants with and without pyramiding in F4 generation
2.2 7OE亚基基因与黑麦碱基因聚合位点的确定
为确定7OE亚基基因与黑麦碱基因发生聚合的位置,首先对1B染色体长臂上的4个SSR标记Xgwm124、Xgwm259、Xgwm268和Xgwm582在2个亲本间的多态性进行检测,发现Xgwm259和Xgwm582在亲本间具有多态性。进一步利用这2个标记对6个后代植株(3个纯合聚合植株,3个非聚合植株)进行检测,发现这6个植株与亲本科农199具有相同的扩增带型(图3A, 3B),说明这2个SSR位点均来自科农199。由于7OE亚基基因位于这2个SSR标记之间[20],因此可以确定7OE亚基基因与黑麦碱基因聚合的位置在1B染色体长臂上,科农199的7+9亚基基因片段被津强6号的7OE+8*亚基基因片段所取代。
A:Xgwm582标记的检测结果;B:Xgwm259标记的检测结果。A:Detection results of Xgwm582 marker; B: Detection results of Xgwm259 marker.图3 F4代部分聚合和未聚合株系的SSR检测结果Fig.3 SSR detection results of some plants with and without pyramiding in F4 generation
2.3 聚合7OE亚基1B/1R易位系的品质
为明确聚合7OE亚基1B/1R易位系的品质,对温室种植的聚合和未聚合7OE亚基的1B/1R易位系植株及其亲本进行了SIG测定(表2),发现在1B/1R易位系中,用5+10优质亚基取代2+12亚基后(表2中的1、2和3号植株),SIG值显著高于不含5+10优质亚基的亲本科农199,但仍显著低于亲本津强6号;在聚合5+10优质亚基的基础上再引入7OE优质亚基后(表1中的4、5和6号植株),4号和5号植株的SIG值进一步显著提高,而且与津强6号相当,说明这2个植株中1B/1R易位系的品质劣变得到了完全的弥补。
表2 F4代部分聚合和未聚合植株及其亲本的麦谷蛋白溶胀指数Table 2 SIG of some plants with and without pyramiding in F4 generation and their parents
为进一步验证上述结果,把F4代聚合和未聚合7OE亚基的1B/1R易位系及其亲本单株收获的种子播种于大田,成熟后收获株行的种子进行LA-SDS SRC和SDS沉降值的测定(表3),发现在1B/1R易位系中,用5+10优质亚基取代2+12亚基后,LA-SDS SRC和SDS沉降值仍显著高于不含5+10优质亚基的亲本科农199(除F2-34-52-27-43株系的SDS沉降值与科农199无显著差异外);在聚合5+10优质亚基的基础上再引入7OE优质亚基后,这些株系的LA-SDS SRC和SDS沉降值又进一步显著提高,但并未达到强筋亲本津强6号的水平。2个种植环境的结果说明,聚合5+10和7OE优质亚基的1B/1R易位系材料的加工品质显著高于只聚合5+10优质亚基的1B/1R易位系材料。因此,聚合7OE亚基可显著提高1B/1R易位系的加工品质。
表3 F5代部分聚合和未聚合株系及其亲本的乳酸-SDS溶剂保持力和SDS沉降值Table 3 LA-SDS SRC and SDS sedimentation value of some lines with and without pyramiding in F5 generation and their parents
小麦1B/1R易位系具有比较发达的根系,在中国干旱地区发挥了较大的作用。但由于1B/1R易位系的加工品质较差[6-7],在小麦品质育种中,常作为被淘汰的对象[23],如何提高小麦1B/1R易位系的品质仍面临较大挑战。
导入优质亚基是提高小麦1B/1R易位系加工品质的一个重要途径。本研究向小麦1B/1R易位系中不仅导入了5+10优质亚基基因,而且还导入了7OE优质亚基基因,与不含优质亚基的亲本科农199相比,只导入5+10优质亚基基因可以显著提高1B/1R易位系的品质,这与申小勇[10]的报道一致。本研究在聚合5+10优质亚基的基础上进一步聚合7OE优质亚基,发现1B/1R易位系的品质又得到了显著提升,但与含有5+10和7OE优质亚基的非1B/1R易位系亲本津强6号相比,仍存在明显差距。
7OE亚基之所以表现优质是由于它包含2个有功能的7亚基[19],增加的1个7亚基可以提高籽粒麦谷蛋白总量和面筋强度[24]。7OE作为一个对农艺性状没有不良影响的优质亚基[25],在中国冬小麦育种中还没有被利用,与5+10优质亚基聚合是提高小麦1B/1R易位系加工品质的重要育种方向。另外,用离子束诱变创造的黑麦碱位点缺失突变体在常规小麦育种中可以直接利用,但其白粉病抗性降低[26]。利用7OE亚基来提高小麦1B/1R易位系的品质可有效避免这种问题。
本研究得到的聚合7OE亚基的1B/1R易位系材料,尽管其加工品质达不到强筋亲本津强6号的水平,但与中筋亲本科农199比较,加工品质已有显著提高,这些材料是否适合加工优质面条、饺子、馒头等食品,还有待种子量足够时进行全面的品质测定。
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