基于网络药理学和分子对接探讨柴胡桂枝汤治疗类风湿性关节炎的作用机制

李俊辉,王琳,王芳

1.河南省洛阳正骨医院,河南省骨科医院,河南 郑州 450016; 2.河南中医药大学,河南 郑州 450046

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种常见的自身免疫性疾病,以血管翳和滑膜炎为主要病理改变,导致软骨破坏和关节变性,早期会出现全身多关节对称性疼痛、肿胀、僵硬[1]。除关节病变外,还可损害关节外多器官,包括心、肾、肺、消化系统、眼睛、皮肤和神经系统等[2-3]。RA患者发生严重感染、骨质疏松症、心血管疾病、死亡的风险高于普通人群,严重影响患者生存质量,给社会发展带来了沉重负担[4]。

中医药是中国传统文化之瑰宝,源远流长,在认识及治疗本病上具有独特的优势。现代研究也表明,中医药可抑制炎症,缓解RA症状,延缓关节骨损害进展[5-6]。柴胡桂枝汤出自张仲景《伤寒论》,顾名思义,该方是小柴胡汤及桂枝汤的合方,包含桂枝、柴胡、黄芩、芍药、人参、甘草、半夏、大枣及生姜九味中药,具有温通经脉、和解表里、调和营卫之功效。本方疏通三焦,太阳、少阳经同治,调达全身气机,气血正常运行则痹痛自除,对于RA的治疗有确切的疗效[7]。

但柴胡桂枝汤治疗RA的作用机制尚未明确,中医药认识疾病的整体观念及辨证论治理念与网络药理学的原则一致[8-9],网络药理学通过构建“疾病-基因-靶点-药物”网络表现药物与疾病之间的关系,探讨中医治疗疾病“多靶点、多成分、多途径”的机制[10]。因此,本研究以网络药理学及分子对接方法为基础对柴胡桂枝汤治疗RA的有效成分、核心靶标及相关通路进行阐述,确定潜在的作用机制,为临床应用提供理论依据及新的治疗思路。

1.1 柴胡桂枝汤中药物有效成分及对应靶点筛选登录中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP,http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.Php)并检索柴胡桂枝汤中包含的中药成分(柴胡、桂枝、黄芩、人参、半夏、芍药、大枣、甘草、生姜),以口服生物利用度(oral bioavailability,OB,OB≥30%)和类药性(drug like,DL,DL≥0.18)为筛选条件收集符合条件的活性成分和对应靶点,使用perl脚本运行处理药物有效成分与分子靶标,筛选有效靶标信息,并与Universal Protein数据库(https://www.uniprot.org/)中经过“Reviewed”“Humam”过滤得到的有效信息比对、整理为药物靶点ID转化后的基因symbol信息。

1.2 RA相关靶点的获取在Genecards、OMIM、TTD、PharmGKB、DrugBank等疾病数据库中分别检索关键词“Rheumatoid arthritis”,其中,Genecards数据库选择“relevance scores”大于10的基因靶点,与其他四个数据库靶点取交集,从而得出RA相关的疾病靶点,使用R语言venn程序包将得到的疾病相关数据进行合并,获得交集基因的数目,并将所得疾病相关靶点数据合并、去重,得到最终的疾病靶点集。

1.3 柴胡桂枝汤-RA交集靶点的筛选使用venn程序包将中药与疾病相关靶点取交集,获得柴胡桂枝汤药物有效成分中直接与疾病有关的靶点。

1.4 Cytoscape交互网络文件准备使用perl脚本分析比对,将整理为药物靶点ID转化形成的symbol信息与疾病基因靶点整理为“Network”“Type”文件进行后续分析。

1.5 网络模型的构建及分析将1.4中“Network”“Type”文件导入Cytoscape V3.8.0中对其进行可视化处理,构建疾病-药物-成分-靶点网络,并通过节点度值(degree)筛选其关键有效成分。

1.6 蛋白之间相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络构建及拓扑分析借助STRING(https://string-db.org/)数据库,将获得的交集靶点导入,选定物种为“Homo Sapiens”进行PPI网络构建,交互得分阈值设定为0.9,并隐藏网络中断开连接的节点,将TSV数据格式文件导出并利用Cytoscape软件对PPI网络进行蛋白互作网络集中性分析和评估,根据其网络中心度进行拓扑分析,筛选得到核心靶点。

1.7 基因本体(gene ontology,GO)数据库富集分析和京都基因和基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析首先,安装R语言BiocManager程序包,利用library(org.Hs.eg.db)进行Symbol转为EntrezIDs的转换,然后安装R语言DOSE、clusterProfiler等相关程序包,对靶点交集基因ID进行GO富集与KEGG富集分析。GO富集分析包括显著富集生物学过程(biological process,BP)、细胞成分(cell component,CC)、分子功能(molecular function,MF),并将前10项绘制成柱状图。KEGG富集分析绘制的气泡图包括显著富集前的30条通路,据此推断出柴胡桂枝汤作用于RA的潜在机制。

1.8 分子对接验证通过PubChem搜索小分子配体结构2D文件,导入Chem3D软件生成3D优化结构,并保存为mol2格式文件,于PDB数据库得到大分子蛋白结构,经PyMOL去除水分子和小分子配体并保存PDB格式文件,在AutoDock软件中将大分子文件加氢处理,导出pdbqt文件,设置合适空间对接Box进行分析,导入pdbqt于OpenBabel软件转化为pdb格式,通过PyMOL软件导入文件,进行可视化处理。

2.1 柴胡桂枝汤有效活性成分及作用靶点通过TCMSP数据库中每个药物OB与DL值筛选,得到柴胡桂枝汤的有效成分共 263 个,结合分子靶标共14 297个,将有效活性成分所对应的靶点通过Uniprot数据库进行标准化处理,然后选择“Reviewed”“Human”,得到下载标准靶点名。进行匹配、删除重复值后获得靶点3 918个,柴胡桂枝汤靶点信息概况见表1。

表1 柴胡桂枝汤成分、靶点及数据库匹配结果

2.2 疾病靶点和潜在靶点获取在Genecards、OMIM、TTD、PharmGKB、DrugBank等5个疾病数据库中分别检索“gastroesophageal reflux disease”,其中,Genecards数据库选择“relevance scores”大于10的基因靶点,去除重复项目后共获得关于RA的靶点373个,绘制韦恩图。将得到的263个药物活性成分与3 973个疾病靶点进行交集,取交集后获得169个靶点,即为柴胡桂枝汤治疗RA的潜在作用靶点,并绘制韦恩图,见图1。

注:A:疾病靶点图;B:潜在作用靶点图

图2 “活性成分-靶点”网络图

2.3 构建中药-活性成分-作用靶点-通路网络运用Cytoscape V3.8.0软件将柴胡桂枝汤中的化合物构建出柴胡桂枝汤的中药-活性成分-靶点-通路网络,选取degree较前的20个关键化合物与靶点作图,如图 2 所示。由结果推测,柴胡桂枝汤通过多种化学成分干预多个靶点治疗RA。柴胡桂枝汤中作用于RA的主要化学成分槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、汉黄芩素(wogonin)、柚皮素(naringenin)、黄芩素(baicalein)、甘草查尔酮A(licochalcone A)等degree较大,且与多靶点连接,说明其在网络中发挥关键作用,且 degree 排名前20的关键化合物中14个都独立来自甘草。倒置菱形为177个靶点基因,外侧圆圈以及颜色代表不同中药在化合物成分中占比,图中深灰色为生姜,粉色为大枣,浅蓝色为柴胡,深红色为甘草,绿色为黄芩,黄色为芍药,深蓝色为人参,紫色为半夏,浅绿色为桂枝。

2.4 构建 PPI 模型图将药物-疾病交集靶点基因导入STRING数据平台获得PPI模型,图中共有189个节点,2 985条边,每个节点连起来的边代表共同基因之间的关联度,关联程度高低与边的粗细成正比,节点为具体的共同基因,见图3。

图3 柴胡桂枝汤治疗RA潜在靶点的PPI网络图

2.5 柴胡桂枝汤与RA相互作用核心靶基因从STRING数据平台导出的TSV格式文件,导入到CytoScape V3.8.0,用Tools工具分析网络拓扑属性,用CytoNCA插件对PPI网络进行蛋白互作网络集中性分析和评估,以进一步分析PPI模型的核心靶基因。根据介度中心性、接近中心性、程度中心性、特征向量中心性、局部边连通性和网络中心性等相关指标对基因进行筛选,后续分析大于所有指标中位数的基因,经过筛选后,最后获得核心基因分别是MYC、MAPK14、HIF1A、AKT1、CDKN1A、ESR1、STAT1、RELA、MAPK1、FOS、EGFR、CCND1、TP53、STAT3、MAPK3,见图4。

注:初步构建的PPI网络经两次筛选后的潜在关键靶点

2.6 GO与KEGG富集分析安装R语言程序包,将交集基因Symbol转为EntrezIDs格式,设置P值和矫正后的P值≤0.05为过滤条件,并去除基因id为NA的基因,将柴胡桂枝汤作用于RA的169个潜在靶点进行GO分析,结果得到对外来反应的刺激(response to xenobiotic stimulus)、膜筏(membrane raft)、脱氧核糖核酸-结合转录因子结合(DNA-binding transcription factor binding)等2 468个生物过程、82种细胞组分和203种分子功能。选取BP、CC、MF排名前10的GO条目绘制气泡图。KEGG通路富集分析最终得到179条通路,选取KEGG前30的条目绘制柱状图,包括脂质与动脉粥样硬化(lipid and atherosclerosis)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、化学致癌的受体激活(Chemical carcinogenesis-receptor activation)、AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)等关键通路,见图5。

图5 GO富集分析气泡图(左)和KEGG通路分析柱形图(右)

2.7 分子对接分析及可视化结果选取PPI网络中degree排名前4的潜在关键靶点进行分子对接,活性物质与蛋白质的亲和力和构象的稳定性程度以对接分数表现,结合能的数值越低,则两者的结合能力越强,具体结果见表2。分子对接结果表明,ESR1与naringenin、RELA与baicalein、丝裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)14和黄芩素(baicalein)、山柰酚(kaempferol)、柚皮素(naringenin)、槲皮素(quercetin)、汉黄芩素(wogonin)的结合能均小于-5.0 kcal·mol-1,分别为-5.6 kcal·mol-1、-5.76 kcal·mol-1和-6.3 kcal·mol-1、-5.36 kcal·mol-1、-6.47 kcal·mol-1,说明基因与柴胡桂枝汤中的有效成分有着良好的结合力。利用PyMOL软件将分子对接结果进行可视化,MAPK14与槲皮素、山柰酚、汉黄芩素、柚皮素、黄芩素的3D分子对接可视化结果见图6。

注:A:MAPK14与槲皮素;B:MAPK14与山柰酚;C:MAPK14与汉黄芩素;D:MAPK14与柚皮素;E:MAPK14与黄芩素

表2 柴胡桂枝汤治疗RA中“药物-成分-靶点”网络中与其存在作用关系的化合物结合能

目前,RA影响全球约0.5%～1.0%的人口[11],针对此病的药物治疗一般为非甾体抗炎药、传统风湿抗炎药(DMARDs)及生物制剂,但应用这些也有一定的不良反应,研究表明,非甾体抗炎药对胃肠道有较强的刺激,发生心血管疾病的风险也大大增加[12-13]。

本病属于中医学“痹证”范畴,因其病情复杂,病程长,后代医家也称其为“顽痹”“尪痹”[14]。柴胡桂枝汤主治“支节烦疼”,此与痹证表现一致[15],该方气血同治,调和营卫,固卫腠理,散风、寒、湿诸邪,扶养自身正气,正强邪去则痹痛自除[16]。

本研究以网络药理学技术为方法探讨柴胡桂枝汤治疗RA的作用机制,构建的“药物-活性成分-靶点”网络图提示,柴胡桂枝汤作用于RA可能是通过槲皮素、山柰酚、汉黄芩素、柚皮素、黄芩素、甘草查尔酮A等核心活性成分为物质基础实现的。槲皮素是一种天然类黄酮,已经广泛应用治疗自身免疫性疾病,发挥抗感染、抗氧化作用[17]。相关研究表明,槲皮素通过抑制中性粒细胞活性,促进其凋亡,降低体内炎症细胞的水平,从而改善RA小鼠的关节炎症表现[18]。山柰酚对FLS的增殖和迁移至关重要[19],通过阻断MAPK途径的活化来抑制类风湿性关节炎FLS的迁移和侵袭,减少炎症反应,延缓关节软骨的破坏[20]。汉黄芩素通过靶向作用NF-κB/MAPK信号通路,改善氧化应激标志物,从而减缓RA关节炎症[21]。有研究提示,柚皮素、黄芩素、甘草查尔酮A均可减少炎症细胞浸润及滑膜损伤,抑制RA发展[22-24]。

通过PPI网络分析和两次筛选,最终我们得到MAPK14、HIF1A、ESR1、RELA、AKT1、MAPK1、FOS、STAT3、MAPK3等15个核心作用靶点。肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1和白细胞介素-6是参与控制RA免疫反应的促炎细胞因子,与炎症反应和激活破骨细胞活性密切相关[25]。MAPK14、MAPK1、MAPK3均属于MAPK家族,可以调节这些促炎细胞因子的产生,在细胞增殖、存活、凋亡和侵袭方面起着关键作用[26]。研究表明,RELA可以直接介导NLRP3炎症小体活化,还可通过miR-30a作为前馈方式间接介导NLRP3的表达,经ReLA/MicroRNA-30a/NLRP3信号轴影响巨噬细胞中的NLRP3炎性小体表达,从而参与类风湿性关节炎的发生[27]。ESR1是介导雌激素发挥生物学作用的分子,动物实验表明,miR-203负调控雌激素受体α,从而导致大鼠关节细胞炎症聚集和加剧关节软骨破坏[28]。许多研究提示,与男性RA患者相比,女性RA患者的预后较差,ESR1基因与关节软骨调控密切相关,其会增加RA患者发生关节骨破坏的风险[29]。

笔者借助KEGG通路富集分析发现,柴胡桂枝汤治疗RA的主要通路包括脂质与动脉粥样硬化、PI3K-Akt信号通路、化学致癌的受体激活、AGE-RAGE信号通路等通路。PI3K-Akt通路是参与多种细胞过程的最重要通路之一,可调节细胞代谢,参与生长因子及多种细胞因子的信号传导[30]。该通路受PTEN、SHIP、TNF-α、TGF-β、TRAI等因子调控,控制RA患者关节滑膜细胞增殖与凋亡的平衡状态[31]。研究表明,抑制 PI3K-Akt信号通路的表达可降低关节炎症水平,抑制破骨细胞分化,起到治疗RA骨破坏的效果,同时该信号通路与FLS滑膜细胞的增殖与迁移密切相关[32-33]。晚期糖基化终产物与关节炎、阿兹海默症、糖尿病等疾病的进展密切相关,其可与AGE受体相互作用,介导NF-κB活化,诱导NLRP3炎症小体释放,进而引起组织炎症损伤[34]。分子对接结果表明,药物有效成分均可与核心靶点进行自发结合,其中,ESR1与柚皮素、RELA与槲皮素、AKT1与汉黄芩素、MAPK14与每个核心活性成分均以较高结合能结合,显示出良好的稳定性,提示ESR1、RELA、MAPK14、AKT1可能是柴胡桂枝汤治疗RA的核心靶点。

综上所述,柴胡桂枝汤治疗RA具有多靶点、多成分、多通路的特点,其可能通过槲皮素、山柰酚、汉黄芩素、柚皮素、黄芩素等核心活性成分作用于MAPK14、ESR1、RELA、AKT1、MAPK1、FOS、MAPK3等核心靶点,调节PI3K-Akt信号通路、AGE-RAGE信号通路等通路调节免疫,减轻炎症反应,缓解类风湿关节疼痛,为临床应用提供了理论依据。但本研究仅限于采用分子对接形式进行理论验证,有待进一步的体外实验加以验证。

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