周 晶，卫真真，浦匀舟，李 玲，朱惠蓉，季 青，李红山
1.浙江省宁波市第二医院中西医结合肝病科（浙江 宁波 315010）；
2.上海中医药大学附属曙光医院肿瘤科（上海 201203）；
3.上海市第一人民医院嘉定分院实验医学中心（上海 201803）；
4.浙江省消化系统肿瘤诊治及研究重点实验室（浙江 宁波 315010）
大肠癌是临床常见的消化系统恶性肿瘤，其发病率和病死率呈逐年上升趋势，40%～50%的大肠癌患者确诊时已属晚期［1-2］。西妥昔单抗（CET）是针对表皮生长因子受体（EGFR）研制的靶向药物，可显著延长KRAS野生型晚期大肠癌患者的总生存期［3］。近年来，靶向治疗已经成为改善晚期大肠癌患者生存预后的重要手段，但由于耐药问题，CET的临床反应率仅为15%～20%［4］。原发和继发耐药是CET临床应用的瓶颈，亟待解决。课题组前期研究［5］发现，左金丸（ZJW）具有抑制肠癌细胞增殖、促进肠癌细胞凋亡和逆转化疗药物多药耐药的作用，其机制与调控核因子-κB（NF-κB）信号通路相关。本研究以KRAS突变人结肠癌HCT116细胞为原发耐药模型，从体内、体外两个方面研究ZJW 对CET 耐药的逆转作用，以期为抗靶向治疗耐药中药的进一步开发应用提供依据。
1.1 实验材料
1.1.1 细胞KRAS突变人结肠癌细胞HCT116，购自中国科学院细胞库，由上海中医药大学附属曙光医院肿瘤实验室保存。使用RPMI 1640完全培养基［含10%胎牛血清（FBS），100 U/mL 青霉素-链霉素混合液］培养细胞，培养环境为37 ℃、5% CO2，单层生长，实验时取对数生长期的细胞。
1.1.2 动物 SPF 级雌性裸鼠16 只，4～6 周龄，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司（动物生产许可证号：SCXK2017-0005），保持在特定的无病原体条件下进行研究。控制室温20 ℃，相对湿度60%，12 h/12 h 明暗循环，自由饮水，实验前12 h 禁食。动物实验方案获得上海中医药大学动物伦理委员会审查批准（伦理编号：PZSHUTCM200724027），所有实验小鼠均根据动物伦理学标准进行实验，并符合《中国实验动物管理条例》的规定和一般建议。
1.1.3 药物及试剂 制吴茱萸（批号：111209）、黄连（批号：111028），购于上海康桥药业有限公司，由上海中医药大学中药研究所制备水提物并进行质量控制。按ZJW 原方比例（黄连∶吴茱萸为6∶1）称取中药饮片，用乙醇（1∶8，V/V）回流提取混合物（70 g）2 次，每次1 h。滤液浓缩后真空干燥，温度为-80 ℃，干粉得率为21.2%。实验前称取适量醇提物干粉，用电子天平准确称量，溶于1 mL 二甲亚砜（DMSO）中，经超声涡旋使其充分溶解，0.22 μm 滤器过滤并配制成浓度为1 g·mL-1的ZJW 溶液，4 ℃保存，用于后续实验。采用高效液相色谱法（HPLC）检测ZJW 溶液中表小檗碱、小檗碱、黄连碱、吴茱萸碱及吴茱萸次碱的含量，从而进行质控。
CET 注射液（100 mg/20 mL），德国默克公司（批号：G009QB）；
CCK-8 检测试剂盒，日本同仁株式会社（批号：CK04）；
细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司（批号：C1052）；
细胞凋亡检测试剂盒（FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I），美国BD pharmingen公司（批号：556547）；
BCA蛋白分析试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司（批号：P0012S）；
参照样品，赛默飞世尔科技（中国）有限公司（批号：26617）；
ECL 化学发光液，上海雅酶生物医药科技有限公司（批号：SQ201）；
NF-κB p65兔抗、磷酸化核因子-κB（p-NF-κB）p65 兔抗、B 淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）鼠抗、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）兔抗、β-肌动蛋白（β-actin）兔抗，美国Cell Signaling Technology 公司（批号分别为8242、3033、15071、9664、4970）；
HRP 标记山羊抗兔二抗、Alexa Fluor 488标记山羊抗兔二抗、Cy3标记山羊抗兔二抗，上海碧云天生物技术有限公司（批号分别为A0208、A0423、A0516）；
实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）预混液（HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR）、定量PCR 检测试剂盒（ChamQ SYBR qPCR Master MixPCR），南京诺唯赞医疗科技有限公司（批号分别为R222-01、Q311-02）。
1.1.4 主要仪器 电子天平，德国Sartorius公司（型号：ES120）；
CO2恒温培养箱，美国ThermoFisher 公司（型号：FORMA 3111）；
超净工作台，新加坡ESCO 公司（型号：SVE-6A1）；
倒置相差显微镜，日本Olympus 株式会社（型号：CKX41/U-RFLT50）；
酶联免疫检测仪，美国Biotek 公司（型号：Synergy2）；
流式细胞仪，美国BD 公司（型号：FACSCantoⅡ）；
实时荧光定量PCR 仪，美国ABI公司（型号：ABI7300）。
1.2 细胞实验
1.2.1 CCK-8 法检测细胞增殖 将HCT116 细胞以1×104/100 μL 接种于96 孔板中，培养24 h，待细胞完全贴壁后分别加入不同浓度的ZJW（6.25、12.5、25、50、100 mg·L-1），以观察ZJW 单药对细胞增殖的影响，并确定无毒剂量（即10 mg·L-1）用于后续实验。ZJW 10 mg·L-1联合不同浓度的CET（62.5、125、250、500、1 000 mg·L-1）干预细胞，以观察ZJW、CET 的联合作用效果。选择ZJW 联合CET 低于IC30的药物浓度（即ZJW 0、5、10 mg·L-1联合CET 0、100、200 mg·L-1）干预细胞，以观察ZJW 与CET 是否存在协同效应。每组设6个复孔。孵育细胞48 h，将CCK-8 试剂与完全培养基按1∶9 的比例配制成工作液，每孔加入100 μL，37 ℃孵育2 h。使用全自动酶标仪检测450 nm 处各孔的光密度（OD），计算生存率，并绘制效应曲线。重复3次。
1.2.2 流式细胞仪检测细胞周期 将处于对数生长期的HCT116 细胞以3×105/孔接种于6 孔板，使用完全培养基培养。待细胞贴壁后，弃去原培养基，分别加入完全培养基（CON 组）、CET 100 mg·L-1（此浓度系依据“1.2.1”项下两药协同效应实验设置；
CET 组）、ZJW 10 mg·L-1（ZJW 组）、CET 100 mg·L-1+ ZJW 10 mg·L-1（ZJW+CET 组）。每组设3 个复孔。作用48 h 后收集细胞，胰酶消化（连同培养基中漂浮的细胞一起收集），消化后的细胞悬液1 000 r/min离心2 min；
弃去上清，缓冲盐溶液（PBS）洗涤，离心（条件同前），70%冰乙醇固定，4 ℃过夜。取出固定的标本，800 r/min 离心5 min，弃去上清；
加PBS 洗涤细胞，再次离心（条件同前），共洗涤2次；
随后加入碘化丙啶（PI）染液室温避光孵育30 min，用流式细胞仪和Mcycle软件检测分析细胞周期。
1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 细胞分组与培养同“1.2.2”。每组设3个复孔。孵育48 h后，将胰酶消化细胞用PBS 洗涤2 次并计数。按照说明书，使用凋亡试剂盒中的1×Binding Buffer 将洗涤后的细胞稀释为1×106/mL单细胞悬液。将300 μL细胞悬液吸收到新的流动管中，分别加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI，轻轻混合后，室温下15 min 进行避光反应，加入200 μL 1×Binding Buffer，在1 h 内完成上机检测。流式细胞仪检测AnnexinV-FITC 阳性细胞和PI 阴性细胞的相对数量，计算细胞凋亡率。未染色的细胞、Annexin V-FITC单独染色的细胞和PI单独染色的细胞作为对照。单色细胞用于调节FL1和FL2通道上的电子补偿。
1.2.4 Western blot 检测细胞中NF-κB p56、Bcl-2 表达
细胞分组与培养同“1.2.2”。每组设3 个复孔。药物作用48 h 后，使用2 mL 预冷PBS 清洗3 次，加入RIPA细胞裂解液，冰上裂解30 min 后，离心收集上清，提取细胞蛋白，BCA 法测定细胞总蛋白浓度。各孔取15 μg的蛋白上样，于10%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离（浓缩胶100 V 电压，60 min；
分离胶120 V 电压，120 min）。将分离后的蛋白电转移（200 mA 电流，120 min）至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，加入5% BSA 封闭液于摇床上室温封2 h。用洗涤缓冲盐溶液（TBST）洗膜3 次，每次10 min，分别加入NF-κB p65、Bcl-2 抗体（体积稀释比例均为1∶1 000），4 ℃反应过夜。次日先以TBST 洗膜3 次，每次10 min。后加入HRP 标记的山羊抗兔IgG 二抗（体积稀释比例为1∶2 000），室温反应2 h。再用TBST 洗膜3 次，每次10 min。按ECL 试剂盒说明进行显影。采用ImageJ 图像分析管理系统对蛋白条带灰度值进行分析。
1.2.5 免疫荧光法检测细胞中NF-κB p65、p-NF-κB p65、Caspase-3 表达 细胞分组与培养同“1.2.2”。每组设3个复孔。药物作用24 h后取出爬片，4%多聚甲醛固定15 min；
0.1% Triton-X-100（PBS 配制）透化10 min，免疫荧光封闭液室温封闭30 min，分别加入一抗NF-κB p56（1∶2 000）和Caspase-3（1∶2 000），4 ℃过夜；
磷酸盐吐温缓冲液（PBST）清洗后加入Alexa Fluor 488 山羊抗兔二抗（1∶1 500），室温孵育2 h；
PBST 清洗后加入一抗p-NF-κB p65（1∶2 000），4 ℃过夜；
PBST 清洗后加入Cy3山羊抗兔二抗（1∶1 500），室温孵育2 h；
二脒基苯基吲哚（DAPI）染色5 min（10 mg·L-1），PBS 清洗后抗淬灭封片剂封片，共聚焦拍照。ImageJ分析荧光强度。
1.2.6 RT-qPCR 法检测细胞中相关基因的表达 细胞分组与培养同“1.2.2”。每组设3个复孔。药物作用48 h后提取细胞，用TRIzol试剂从细胞中提取RNA。根据逆转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA。取适量的cDNA作为反应模板，并根据RT-qPCR 规范进行扩增。以β-actin为内参进行荧光定量PCR 扩增，以检测各组HCT116 细胞NF-κBp65、Bcl-2、Caspase-3mRNA 的表达水平。反应条件：95 ℃预变性30 s；
95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，95 ℃延伸15 s，50个循环。扩增引物由上海生工生物工程技术服务公司合成。各组均设3个复孔，并使用2-∆∆CT方法计算相对表达水平。引物序列见表1。
表1 引物序列
1.3 动物实验
1.3.1 皮下移植瘤生长情况 取16只裸鼠，将2×106个HCT116 细胞皮下注射于裸鼠腋下，当肿瘤的平均大小达到100 mm3左右时将小鼠随机分成4 组，每组4 只。第1 组小鼠每天使用PBS 灌胃，100 μL/次，1 次/d；
第2组、第3 组小鼠尾静脉注射CET，注射剂量为15 mg·kg-1，每周2 次，共注射4 周；
第3 组、第4 组小鼠灌胃给予ZJW，灌胃剂量为2 055 mg·kg-1，1次/d，共28 d［5］。第1 组、第2 组、第3 组、第4 组小鼠分别设为CON 组、CET组、ZJW+CET组、ZJW 组，每2天记录1次较大的肿瘤直径（A和B），并根据公式（V=π/6×A×B2）估算肿瘤体积。根据肿瘤体积和时间绘制肿瘤生长图。
1.3.2 RT-qPCR 法检测皮下移植瘤组织中相关基因的表达情况 给药28 d后剥离肿瘤组织，取20 mg皮下移植瘤组织置于研钵中，加入1 mL TRIzol 提取总RNA，根据逆转录试剂盒将总RNA 逆转录成cDNA。后续检测方法见“1.2.6”项下。以β-actin作为内参分析NF-κB p65、Bcl-2、Caspase-3基因表达情况，并使用2-∆∆CT方法计算相对表达水平。
1.4 统计学方法 实验数据采用SPSS 26.0 统计软件进行分析。计量资料用±s表示，两组间比较采用t检验，两组以上比较采用单因素方差分析。以P<0.05 为差异有统计学意义。
2.1 ZJW、CET 对HCT116 细胞增殖的影响 为避免ZJW 本身的细胞毒性对细胞增殖的影响，本研究检测了ZJW 对HCT116 细胞的细胞毒作用。结果显示，ZJW在HCT116细胞中的IC10剂量为10.71 mg·L-1（图1A），低于此剂量时，细胞的存活率与未经处理的细胞相比没有显著差异。因此，在后续的细胞实验中，本研究使用ZJW 10 mg·L-1联合不同浓度CET 干预HCT116 细胞。CCK-8法检测结果显示，与CET单药相比，ZJW联合CET干预后，HCT116细胞增殖率明显降低［IC50=578.6 mg·L-1（CET），IC50=231.3 mg·L-1（ZJW+CET）］，见图1B。
图1 ZJW、CET对HCT116细胞增殖的影响
为了进一步验证ZJW与CET是否存在协同作用，我们采用不同浓度ZJW联合0、100、200 mg·L-1CET干预HCT116细胞，测得ZJW IC30值分别为17.36、8.47、6.82 mg·L-1，药物联合指数（CI）分别为1.000、0.759、0.934。使用不同浓度CET 联合0、5、10 mg·L-1ZJW 处理HCT116 细胞，测得CET IC30值分别为369.30、237.12、105.16 mg·L-1，CI分别为1.000、0.930、0.861，见图2、表2。以上结果提示，ZJW与CET存在较好的协同作用。
图2 CET与ZJW协同效应检测
表2 ZJW、CET抑制HCT116细胞增殖CI值（IC30）
2.2 ZJW、CET对HCT116细胞周期的影响 与CON组相比，ZJW 组、ZJW+CET组G0/G1期细胞比例降低，S期细胞比例升高（P<0.05）；
与CET 组相比，ZJW 组、ZJW+CET 组G1 期细胞比例降低，S 期细胞比例升高（P<0.05）；
与ZJW 组相比，ZJW+CET 组S 期细胞比例升高（P<0.05）。见图3。
图3 各组细胞周期比较
与CON 组相比，CET 组、ZJW+CET 组G2/M 期细胞比例降低（P<0.05）；
与CET 组相比，ZJW 组G2/M 期细胞比例升高（P<0.05）；
与ZJW组相比，ZJW+CET组G2/M期细胞比例降低（P<0.05）。见图3。
2.3 ZJW、CET对HCT116细胞凋亡的影响 与CON组相比，CET 组细胞晚期凋亡率升高（P<0.05），ZJW 组、ZJW+CET 组细胞早期凋亡率、晚期凋亡率升高（P<0.05）；
与CET 组相比，ZJW 组细胞早期凋亡率升高（P<0.05），ZJW+CET 组细胞早期凋亡率、晚期凋亡率升高（P<0.05）；
与ZJW 组相比，ZJW+CET 组细胞早期凋亡率、晚期凋亡率升高（P<0.05）。见图4。
图4 各组细胞凋亡情况比较
2.4 ZJW、CET 对HCT116 细胞中NF-κB p56、Bcl-2 表达的影响 与CON组比较，CET组、ZJW组细胞中Bcl-2表达降低（P<0.05），ZJW+CET 组细胞Bcl-2、NF-κB p65表达降低（P<0.05）；
与CET组相比，ZJW+CET 组细胞中Bcl-2、NF-κB p65 表达降低（P<0.05）；
与ZJW 组相比，ZJW+CET 组细胞Bcl-2、NF-κB p65 表达降低（P<0.05）。见图5。
图5 各组细胞中NF-κB p65、Bcl-2蛋白表达水平比较（Western blot）
2.5 ZJW、CET 对HCT116 细胞中NF-κB p65、p-NF-κB p65、Caspase-3表达的影响 与CON组相比，ZJW组细胞中Caspase-3表达升高（P<0.05），ZJW+CET组细胞中NFκB p65、p-NF-κB p65 表达降低，Caspase-3 表达升高（P<0.05）；
与CET组相比，ZJW+CET组细胞中NF-κB p65、p-NF-κB p65 表达降低，Caspase-3 表达升高（P<0.05）；
与ZJW 组相比，ZJW+CET 组细胞中NF-κB p65、p-NF-κB p65表达降低，Caspase-3表达升高（P<0.05）。见图6。
图6 各组细胞中NF-κB p65、p-NF-κB p65、Caspase-3表达水平比较（免疫荧光）
2.6 ZJW、CET 对HCT116 细胞Bcl-2、NF-κBp65基因表达的影响 与CON 组相比，ZJW 组、ZJW+CET 组细胞Bcl-2、NF-κBp65mRNA 表达降低（P<0.05）；
与CET组相比，ZJW 组、ZJW+CET 组细胞Bcl-2、NF-κBp65mRNA 表达降低（P<0.05）；
与ZJW 组相比，ZJW+CET 组细胞Bcl-2、NF-κBp65mRNA 表达降低（P<0.05）。见图7。
图7 各组细胞Bcl⁃2、NF⁃κB p65基因表达水平比较
2.7 ZJW、CET 对裸鼠皮下移植瘤生长的影响 整体来看，随着时间的推移，CON 组、CET 组裸鼠瘤体体积逐渐增大，而ZJW 组、ZJW+CET 组裸鼠瘤体生长较为缓慢。给药28 d 后剥离瘤体，与CON 组相比，ZJW 组、ZJW+CET 组裸鼠皮下移植瘤体积缩小（P<0.05）；
与CET 组相比，ZJW、ZJW+CET 组裸鼠皮下移植瘤体积缩小（P<0.05）；
与ZJW 组比较，ZJW+CET组裸鼠皮下移植瘤体积缩小（P<0.05）。见图8。
图8 各组裸鼠皮下移植瘤生长情况比较
2.8 ZJW、CET 对裸鼠皮下移植瘤组织中NF-κB p65、Bcl-2、Caspase-3基因表达的影响 与CON 组相比，ZJW组、ZJW+CET 组瘤体组织中NF-κBp65、Bcl-2mRNA 表达降低，Caspase-3mRNA 表达升高（P<0.05）；
与CET 组相比，ZJW组瘤体组织中Caspase-3mRNA表达升高（P<0.05）；
与ZJW组相比，ZJW+CET组瘤体组织中Caspase-3mRNA表达升高（P<0.05）。见图9。
图9 各组裸鼠皮下移植瘤组织中NF-κB p65、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达水平比较
ZJW 作为一种经典中药复方，由黄连、吴茱萸按6∶1 配比组成，黄连苦寒，清心泻肝，吴茱萸辛热，引热下行，二药一主一辅，一寒一热，相反相成［6］。全方辛开苦降、寒热并用，主治肝火犯胃、肝胃不和，症见口苦胁胀、胃脘痛、呕吐吞酸，与临床上肿瘤化疗后引起的消化道反应相似［7］。因此，ZJW 可用于缓解肿瘤化疗后引起的相关症状及耐药反应［8-10］。
本研究结果显示，ZJW 联合CET 可有效抑制HCT116 细胞的增殖；
与CET 单药比较，ZJW 联合CET可以使HCT116 细胞的S 期表现出明显阻滞，从而抑制细胞增殖，升高HCT116细胞凋亡的比例。以上结果提示，ZJW 能够在一定程度上增强HCT116 细胞对CET 的敏感性。动物实验结果显示，与CON 组相比，CET+ZJW 组的抑瘤效果明显增强（P<0.05），给药28 d 后，CET+ZJW 组裸鼠皮下移植瘤瘤体体积最小（P<0.05），提示ZJW 可以增强CET 在体内的抗肿瘤作用。可见，ZJW 在体内、体外均能增强肿瘤细胞对CET 的敏感性，但其具体机制尚不清楚。
NF-κB 是细胞内重要的核转录因子，参与机体的免疫反应、免疫应答，可以调节细胞凋亡、应激反应［11］。研究［12-14］表明，NF-κB 与多种恶性肿瘤如肺癌、乳腺癌、卵巢癌发生的耐药具有相关性，其机制可能与调节靶蛋白Bcl-2、Bcl-2相关蛋白A1、凋亡抑制蛋白（IAPs）、白介素-13、肿瘤坏死因子等抑凋亡因子的表达有关，其中Bcl-2 蛋白家族是导致许多半胱氨酸酶活化的关键调控因子，参与细胞凋亡过程［15-18］。Ricca 等［19］研究发现，在乳腺癌耐药MCF7ADR细胞中过表达Bcl-2可以增强NF-κB的转录活性，提示Bcl-2介导的NF-κB因子活性调控可能是MCF7ADR细胞促进耐药的重要机制。Aslan等［20］的研究表明，NF-κB对Bcl-2的调控在口腔鳞状细胞癌的进展中起重要作用。同样，Chen 等［21］的研究发现，激活NF-κB 后导致Bcl-2 的升高是发生非小细胞肺癌化疗耐药的重要原因。
课题组前期研究［5］发现，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/NF-κB通路参与调控人结肠癌细胞多药耐药，因此我们推测NF-κB信号通路同样可以通过调控细胞凋亡途径参与KRAS突变型大肠癌CET 耐药过程。本研究中，Western blot 与RT-qPCR 检测结果均证实了NF-κB、Bcl-2 与大肠癌HCT116 细胞凋亡的相关性，具体表现为CET 干预HCT116 细胞后，细胞中Bcl-2蛋白和Bcl-2mRNA 表达水平均有所下降，但NF-κB 的变化不明显；
ZJW联合CET干预HCT116细胞后，细胞中NF-κB、Bcl-2 的蛋白和NF-κB、Bcl-2mRNA 表达水平均降低。上述提示ZJW 对大肠癌HCT116 细胞CET 耐药的逆转作用可能与NF-κB、Bcl-2调控的细胞凋亡相关。
综上，我们通过体外、体内研究初步证实，ZJW 可通过抑制细胞增殖、阻滞细胞周期、促进细胞凋亡等途径逆转KRAS突变大肠癌细胞对CET 的耐药，继而抑制大肠癌生长，其机制可能与调控NF-κB/Bcl-2/Caspase-3通路相关。
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