付镓榕，徐荣，郭刚军，马尚玄，邹建云
云南省热带作物科学研究所（景洪 666100）
魔芋是天南星科（Araceae）魔芋属（Amorphophallus）多年生草本植物。全球有魔芋220余种，其中我国就有25种，主要分布在西南和华南地区，云南省有15种魔芋资源，为魔芋资源最丰富的省份[1]。魔芋作为我国的传统中药材，有着悠久的历史，涉及种植、食用及药用，据《开宝本草》和《本草纲目》中的记载，魔芋性寒、味平，有化痰、行瘀消肿的作用，可以治疗跌打损伤、咳嗽、痈肿风毒、疟疾、积滞等疾病。在现代研究发现，魔芋对肝脏[2]、肥胖[3]、糖尿病[4]、炎症性肠病[5]等方面均有治疗作用。除食用和药用价值外，魔芋葡甘露聚糖（Konjac Glucomannan，简称KGM）还可作为天然高分子材料，在食品、医药、化工等领域有广泛应用[6]。
目前，魔芋的化学成分的研究报道主要以脂肪、蛋白质、粗纤维、葡甘聚糖、淀粉等为主[7-10]，由于KGM为主要成分且具有较高的经济价值高，故其它成分的用途开发较少，特别是对其药用方面的开发利用极少[11]。植物多酚具有防止心脑血管疾病[12]、抗肿瘤[13]、抗氧化活性[14]等功效，而对于魔芋多酚的研究较少。只有对多酚的含量进行准确测定，才能对多酚提取技术、多酚产品的制备、功效等展开研究。Folin-Ciocalteu比色法是目前多酚测定主要采用的方法，但不同样品选用的检测条件差异较大，比如碳酸钠溶液的浓度及用量，显色温度也不同主要在30～50℃之间，显色时间也从30到120 min不尽相同[15-18]。目前对魔芋多酚的定量测定方法优化尚未见报道，因此很有必要对Folin-Ciocalteu比色法的测定条件进行系统分析，以确定最优的检测条件。
文章通过单因素试验结合响应面法建立了Folin-Ciocalteu比色法测定魔芋多酚含量的方法，并对该方法的稳定性、精密度、重复性、回收率进行考察。通过研究为魔芋的成分分析提供理论依据，期望提升魔芋的综合利用率增加魔芋的附加值。
1.1 材料与试剂
试验所用弥勒魔芋（云南省热带作物科学研究所试验基地）；
福林酚试剂（Folin-Ciocalteu试剂）（国药集团化学试剂有限公司）；
没食子酸（3, 4,5-三羟基苯甲酸）标准品（Sigma公司）；
无水碳酸钠、无水乙醇等试剂（国药集团化学试剂有限公司）。
1.2 仪器与设备
BGZ-70电热恒温鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司）；
HHS恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司）；
ME204E电子分析天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；
KQ-500VDE超声波清洗机（昆山市超声仪器公司）；
T-UV1810紫外分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）；
114B粉碎机（永历制药机械有限公司）。
1.3 魔芋多酚的提取
将清水洗净的魔芋球茎去皮切成3～5 mm薄片，于电热恒温鼓风干燥箱中80 ℃烘至恒重，粉碎过筛制得魔芋粉，备用。参照尹娜等[19]的试验方法稍作修改，准确称取魔芋粉5 g于100 mL容量瓶中，加入体积分数为60%乙醇定容，超声波提取30 min，静置30 min后取50 mL上清液于容量瓶中，用蒸馏水定容至250 mL，制得多酚提取液，备用。
1.4 魔芋多酚测定条件的优化
1.4.1 最佳测定波长的确定
分别准确移取1.0 mL魔芋多酚提取液和40 μg/mL的没食子酸标准溶液到10 mL容量瓶内，再分别加入1.0 mL福林酚试剂、5 mL蒸馏水、3 mL 5%的碳酸钠溶液，在50 ℃水浴60 min，用分光光度计在400～1 000nm下进行吸收光谱扫描，确定最佳测定波长。
1.4.2 碳酸钠溶液用量的确定
分别准确移取1.0 mL魔芋多酚提取液到10 mL容量瓶内，再分别加入1.0 mL福林酚试剂，然后分别加入1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5和5 mL 5%碳酸钠溶液，蒸馏水定容至10 mL，50 ℃水浴反应60 min后在769 nm波长处测吸光度，以确定5%碳酸钠溶液的最佳用量。
1.4.3 福林酚试剂用量的确定
分别准确移取1.0 mL魔芋多酚提取液到10 mL容量瓶内，再分别加入0.25，0.5，0.75，1，1.25，1.5，1.75和2 mL福林酚试剂，然后分别加入5%碳酸钠溶液3 mL，蒸馏水定容至10 mL，50 ℃水浴反应60 min后在769 nm波长处测吸光度，以确定福林酚试剂的最佳用量。
1.4.4 反应温度与时间的确定
准确移取1.0 mL魔芋多酚提取液到10 mL容量瓶内，再依次加入1.25 mL福林酚试剂，3 mL 5%碳酸钠溶液，蒸馏水定容至10 mL后分别置于25，30，35，40，45，50，55，60，65和70 ℃水浴反应，测定其分别反应20，40，60，80，100和120 min后在769 nm波长处测吸光度，以确定最佳反应温度与时间。
1.4.5 响应面优化试验设计
根据Box-Behnken试验设计原理，在单因素的基础上，选择5%碳酸钠用量、福林酚试剂添加量、反应温度3个因素，进行三因素三水平的响应面分析，因素与水平设计见表1。
表1 响应面试验因素水平与编码值
1.5 测定方法的评价
1.5.1 稳定性试验
取1.3小节中制备的样品提取液，按照1.4.5小节响应面试验确定的最佳测定条件进行反应，静置0，1，
2，3，4和5 h后再次测量其吸光度，计算出每次测定的相对标准偏差，以评价该检测方法在静置一定时间后的稳定性。
1.5.2 精密性试验
采用试验确定的最佳测定条件对同一魔芋样品提取液进行10次多酚含量测定，计算相对标准偏差，评价该测定方法的精密度。
1.5.3 重复性试验
取5份同一魔芋样品，按照1.3.1小节中的方法制备提取液，用试验确定的最佳测定条件测定吸光度，计算相对标准偏差，评价该测定方法的重现性。
1.5.4 没食子酸加标回收试验
取6份已知多酚含量的魔芋提取液，分别加入不同质量的没食子酸标准品，然后按照试验确定的最佳测定条件测定其多酚含量，计算平均回收率及相对标准偏差，评价该测定方法的准确性。
1.6 样品多酚含量的测定
1.6.1 没食子酸标准曲线的绘制
准确称取10 mg没食子酸，用蒸馏水溶解，并定容至100 mL，得到100 μg/mL的没食子酸标准溶液。分别移取1，2，3，4，5，6，7，8，9和10 mL到10mL容量瓶中，蒸馏水定容，得到没食子酸的质量浓度分别为10，20，30，40，50，60，70，80，90和100 μg/mL。
分别取1 mL各浓度的没食子酸标准溶液于10 mL容量瓶中，依次加入福林酚试剂1.2 mL，5%的碳酸钠溶液2.75 mL，蒸馏水定容至10 mL，62 ℃水浴60 min，以蒸馏水做参比，在769 nm下测定吸光度，以吸光度为纵坐标（Y），反应体系中没食子酸质量浓度为横坐标（X），建立的回归方程为。
1.6.2 样品的测定
准确取1 mL样品溶液于10 mL容量瓶中，加入1.2mL 1 mol/L福林酚试剂，然后加入2.75 mL 5%的碳酸钠溶液，蒸馏水定容至10 mL，62 ℃水浴60 min，以蒸馏水做参比，在769 nm下测定吸光度，用标准曲线回归方程计算得到魔芋提取液的多酚含量。
1.7 数据分析
采用Excel 2019进行数据录入、分析；
使用Origin 2021对进行作图；
用Design-Expert 13统计软件进行响应面优化分析。
2.1 单因素试验
2.1.1 检测波长的确定
在碱性环境中多酚类化合物被钨钼酸氧化，而钨钼酸被还原（使W6+变为W5+）生成蓝色的化合物，蓝色的深浅程度代表着多酚类化合物的含量[20]。将显色反应后的没食子酸溶液和魔芋试样溶液分别用紫外分光光度计于400～1 000 nm波长进行光谱扫描，选出最佳检测波长，结果如图1所示，769 nm处为没食子酸和魔芋试样溶液的最大吸收峰，因此选择769 nm作为检测波长。
图1 标准溶液和样品溶液的吸收光谱
2.1.2 碳酸钠溶液用量的确定
多酚类化合物与福林酚试剂中的钨钼酸反应必须在碱性条件才可以显色，碳酸钠溶液是显色反应中的支持介质，碳酸钠溶液加入量的多少将影响反应体系中碱性的强弱，对显色反应有很大的影响。碳酸钠溶液过量会析出晶体，使吸光度降低[21]。加入不同量5%碳酸钠溶液对吸光度的影响如图2所示，随着碳酸钠溶液用量的增加，反应液的吸光度总体呈现出先上升后下降的趋势，当碳酸钠溶液用量为3 mL时，反应液的吸光度最大，故碳酸钠的用量选择为2.5～3.5 mL较为合适。
图2 碳酸钠用量对吸光度的影响
2.1.3 福林酚试剂用量的确定
福林酚试剂用量决定着多酚化合物是否完全氧化，对显色反应有直接影响。不同的福林酚试剂加入量对吸光度的影响如图3所示，福林酚试剂用量在0.25～1.25 mL的范围内，随着用量的增大，反应液的吸光度逐渐增大，当福林酚试剂用量大于1.25 mL，反应液的吸光度急剧下降后趋于平缓。吴澎等[21]在樱桃酒中总酚含量测定中发现福林酚试剂用量过大会使溶液呈现淡绿色引起吸光度出现下降，作者认为当显色剂过量后反应体系将呈现出显色剂本身的颜色。为确保测定方法的灵敏度高，选择的福林酚试剂用量为
图3 FC试剂用量对吸光度的影响
1～1.5 mL。
2.1.4 反应温度与时间的确定
提取液中的多酚化合物与加入的福林酚试剂反应需要一定的温度及时间。不同反应温度在不同反应时间的吸光度如图4所示，在25～45 ℃条件下反应，吸光度随显色时间的延长而逐渐增大，无相对稳定时间；
75 ℃条件下反应60 min后，吸光度随水浴时间的延长而逐渐降低，说明温度高能加快显色进程，但温度过高会导致反应体系的稳定性较差，50～70 ℃条件下反应，显色60 min后，体系吸光度变化很小，表明显色反应基本完全，显色体系稳定性很好，其中65 ℃条件下显色后吸光度较高且稳定性好，故选择的反应温度范围为60～70 ℃，确定60 min作为反应时间。
图4 反应温度与时间对吸光度的影响
2.2 响应面优化试验
2.2.1 试验结果与方差分析
利用Design Expert 13软件对三因素三水平进行响应面分析，响应面试验设计及试验结果如表2所示。对试验数据进行二次多项式拟合，得到回归模型方程：吸光度（Y）=-2.24+0.17A-1.35B+0.096C+0.26AB-0.004 3AC+0.015BC-0.038A2-0.13B2-0.000 76C2。
表2 响应面试验设计及结果
根据表3分析可知，二次回归模型的F=196.19（P＜0.01），表明该模型达到极显著水平；
失拟项表示模型中数据的变异，失拟项差异不显著（P＞0.05），试验理论和实际值偏差很小，得到的回归模型能够很好地的预测响应值。试验模型的决定系数R2=0.996 1，说明魔芋多酚含量的测定结果与模型预测结果具有良好的一致性，校正系数0.991 0也进一步验证了该模型的可靠性。通过回归方程中F值判断各因素对魔芋中多酚检测的影响主次顺序为C＞B＞A。通过回归模型方差分析得到模型的一次项中碳酸钠用量、福林酚试剂用量、反应温度对魔芋中多酚的测定结果影响均为极显著（P＜0.01），交互项中AB、AC、BC对试验结果的影响极显著（P＜0.01），二次项中A2、B2、C2对试验结果影响均为极显著（P＜0.01）。
表3 回归模型方差分析表
2.2.2 响应面图形分析
响应面3D曲面图的形状反映了各因素交互作用对响应值的影响，结果如图5～图7所示。对魔芋中多酚含量测定的交互项进行考察，响应面图可以评价试验中设置的试验因素对魔芋中多酚含量测定的交互作用[22]，响应面的坡度越陡，说明该因素对魔芋中多酚含量测定的影响越大[23-24]；
反之则表明该因素对魔芋中多酚含量测定的影响越小[21,25]。在交互项对测定浓度的影响中，碳酸钠用量与福林酚试剂用量、碳酸钠用量与反应温度、福林酚试剂用量与反应温度的交互作用均显著，这与方差分析的结果相符。
图5 碳酸钠用量和福林酚试剂用量响应面
图6 碳酸钠用量和反应温度响应面
图7 福林酚用量和反应温度响应面
2.2.3 最佳测定条件的确认
利用Design Expert 13软件对数据进行分析处理，最佳测定条件为5%碳酸钠溶液用量2.756 mL、福林酚试剂用量1.205 mL、反应温度62.44 ℃。在此条件下，预估的吸光度为0.430。参照分析得出的最佳测定条件，在实际操作中稍作调整：5%碳酸钠溶液用量2.75 mL、福林酚试剂用量1.20 mL、水浴反应温度62 ℃，进行5次平行试验进行验证，所测得的吸光度平均值为0.419±0.001，验证试验的结果与分析得出的预估值相近，吻合度达97.35%，说明该模型具有很好的预测性，结果稳定可靠。
2.3 测定方法的评价
2.3.1 稳定性试验
取制备好的魔芋多酚提取液，按照最佳测定条件进行稳定性试验，在与显示剂反应完全后避光放置，不同时间后测定吸光度见表4。随着时间的延长，吸光度有缓慢上升的趋势，但幅度不大，相对偏差为2.13%，说明该方法在一定时间内稳定性较好。
表4 稳定性试验
2.3.2 精密性试验
根据响应面法优化的最佳测定条件进行精密性验证试验，对同一个提取液样品进行10次测定，结果如表5所示。相对偏差为0.75%，说明该方法具有较高的精密度，能满足魔芋多酚的测定要求。
表5 精密性试验
2.3.3 重复性试验
取5份魔芋多酚提取液，用响应面法优化的最佳测定条件测定其多酚含量，结果见表6。相对标准偏差为0.80%，说明该方法具有较好的重现性。
表6 重复性试验
2.3.4 加标回收试验
在6份1 mL的魔芋多酚提取液中分别加入10，20，30，40，50和60 μg的没食子酸标准品，按照响应面法优化的最佳测定条件进行3次检测，试验结果见表7，加标回收试验的回收率最高为101.22%，最低为97.99%，平均回收率为100.07%，相对标准偏差为1.20%。进一步证明了该检测方法的稳定性。
魔芋中多酚检测中反应温度对魔芋中多酚测定的影响最大，其次为福林酚试剂用量，碳酸钠用量的影响最小。参照响应面分析结果，将实际测定条件稍作调整，确定的测定条件为5%碳酸钠溶液用量2.75 mL、福林酚试剂用量1.20 mL、反应温度62 ℃，待其反应60 min后在波长769 nm处测定吸光度。测定方法评价结果表明该检测方法操作过程简单、便捷，重复性、稳定性好，精密度、回收率高，检测结果准确可靠，可为魔芋研究提供试验参考。
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