王萍，陈丽艳，孙银玲，蒙艳丽，王欣，王伟明
黑龙江省中医药科学院（哈尔滨 150036）
气虚血瘀是诸如冠心病、肺心病、高血压病、糖尿病、脑卒中、缺血性中风等多种疾病的重要病理基础，是疾病进展的某个阶段症状综合性的表现，也是老年认知功能障碍的主要病机之一。现代医学研究表明，气虚血瘀证患者血液流变学呈黏聚倾向，微循环障碍，凝血功能亢进，纤溶活性降低等[1-5]。《医林改错》中记载的补阳还五汤为针对气虚血瘀证的主要益气活血方剂，以黄芪为君补气且能固摄经络之气，当归为臣，佐以赤芍，川芎，桃仁，红花活血祛瘀，地龙通经活络。而黄芪具有补气升阳、托毒排脓、敛疮生肌、利水消肿、固表止汗的功效，与大豆共发酵提高了纤溶酶活性，同时又兼具黄芪的补气作用，共同增强并发挥“益气活血”作用[1,6-8]。因此，此次试验通过研究黄芪豆豉对气虚血瘀模型大鼠的血液流变学的影响，探讨其益气活血作用及其机制，为黄芪豆豉的应用提供参考。
1.1 试验动物
清洁级Wistar大鼠（哈尔滨医科大学实验动物学部），70只，雌雄各半，体质量200～220 g，许可证号：SCXK（黑）2019-001。
1.2 试验药物
采用前期课题组研究黄芪豆豉发酵的最优工艺，称取黄芪，加10倍量的水煎煮2次，每次1 h，合并滤液，制成的黄芪提取液质量浓度为75 mg/mL（依据药典用量），以75 mg/mL的黄芪提取液按照1∶1（mL/g）浸泡大豆，待大豆吸尽溶液，装袋，于121 ℃灭菌40 min，接种DCT-1菌液[9]（108CFU/mL，2%），于37 ℃恒温培养36 h制备黄芪豆豉，备用，其中黄芪豆豉和豆豉组因考虑酶活性加入生理盐水利用匀浆机进行匀浆；
补阳还五汤经过煎煮浓缩后均制备成2 g/mL生药量的母液保存，备用，用时用生理盐水配制成所需浓度[10-11]。
1.3 仪器
DL-CJ-2N净化工作台（北京东联哈尔滨仪器制造有限公司）；
DHP-9272恒温培养箱（上海一恒科技仪器有限公司）；
Tecan infinite M200 PRO Nano Quant多功能酶标仪[帝肯（上海）贸易有限公司]；
Legend micro 17R冷冻高速离心机[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；
GEN Ⅲ MicroStation自动微生物鉴定系统（美国 BIOLOG公司）；
LBY-N6B型血液黏度仪（北京普利生仪器有限公司）；
LBY-BX型红细胞变形仪（北京普利生仪器有限公司）；
LBY-NJ型血小板聚集仪（北京普利生仪器有限公司）。
1.4 试剂
血栓素（TXB2，上海生工生物股份有限公司，批号：20190823）；
6-酮-前列腺素PGF1α（南京建成生物工程研究所，批号：20190820）；
氯化钠（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20190108）；
DCT-1菌株（前期课题组分离自淡豆豉饮片）；
黄豆（黑龙江省农业科学院，2017年种植采收）；
黄芪{亳州市张仲景中药饮片有限责任公司，经黑龙江省中医药科学院王伟明研究员鉴定为豆科植物蒙古黄芪[Astragalus membrannceus（Fisch.）Bge. var. mongholicus（Bge.）]}；
Hsiao的干燥根、补阳还五汤（购自黑龙江哈尔滨海辉连锁药店）。
2.1 动物分组、模型构建及给药方法
在中医理论指导下，复合因素诱导气虚血瘀动物模型比较多样。王贤成等[12]采用“力竭游泳+皮下注射肾上腺素”复制气虚血瘀大鼠模型；
庞树玲等[13]采用“饥饿+寒凉+疲劳游泳”复制气虚血瘀大鼠模型；
胡建鹏等[14]采用“饥饿+劳累+高脂饮食+结扎左侧总动脉”复制大鼠缺血性中风气虚血瘀证模型。此研究采用“饥饿+寒凉+力竭游泳”方法建立气虚血瘀大鼠模型，具有造模方法稳定、与临床病症结合度高等优点[5]。
大鼠常规喂养3 d后，进行随机分组，每组10只，分为空白组、模型组、黄芪豆豉高剂量组（6 g/kg）、黄芪豆豉中剂量组（3 g/kg）、黄芪豆豉低剂量组（1.5 g/kg）、豆豉组及补阳还五汤组（阳对药组）。
空白组：采用常规饲养，充足食水。
造模组及各给药组：试验过程中各组每天进行力竭游泳试验，将大鼠置于水深35±5 cm，水温15±2℃，直径90 cm的水桶中进行游泳，以每组大鼠自然沉降没入水中3～5 s不能自主上浮为其疲惫标准。当全组有50%出现自然沉降时，全组停止游泳捞出，使之暴露于空气中自然晾干，连续造模60 d。每日力竭游泳后各组给予正常饮食量的1/2饲养，每天每只大鼠按照40 g/kg喂养。
此研究采用造模与给药同时进行的方式，给药组采用灌胃给药，空白组和模型组给予等量生理盐水，每日1次，连续造模给药60 d。
2.2 血液流变学指标及相关因子分析
2.2.1 血清样品的处理方法
造模给药60 d后，从各组大鼠经腹主动脉取血，室温静置1 h，按3 000 r/min离心10 min，仔细收集上清，保存于-20 ℃冰箱中备用。
2.2.2 血液流变学相关指标检测[5,15]
取4 mL肝素钠抗凝血，采用全自动血液流变仪，设置为高、中和低三个切变率，进行全血黏度测定。
取2 mL枸橼酸钠抗凝血，在3 000 r/min高速离心10 min，取上层血浆，进行血浆黏度测定，仪器同上。
取2 mL EDTA-K2抗凝血，进行红细胞聚集指数测定，仪器同上。
采用酶联免疫吸附分析法（ELISA）测定大鼠血清中血栓素B2和6-酮前列腺素PGF1α（6-keto-PGF1α）的含量[16]。按照试剂盒所提供说明书进行操作及检测，根据标准品的浓度以及对应的吸光度（A）计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的吸光度（A）计算出对应的样品浓度。
3.1 血流变学指标
由表1，表2及图1～图4可得：与空白组相比，模型组的全血低、中、高切差异极显著（**P＜0.01），全血相对指数低切、高切差异极显著（**P＜0.01），说明模型组造模很成功；
与模型组相比，空白组的全血高、中、低切，黄芪豆豉低剂量组的低切、高切，黄芪豆豉中剂量组的低切、高切，黄芪豆豉高剂量组的低切、高切差异极显著（##P＜0.01）；
空白组、黄芪豆豉低剂量组和中剂量组的全血相对指数低切、高切及黄芪豆豉高剂量组的低切差异极显著（##P＜0.01）；
而血浆黏度和红细胞聚集指数无显著性差异（P＞0.05），表明黄芪豆豉可以降低气虚血瘀模型大鼠全血黏度，缓解“黏”“稠”的特征，从而改善血瘀证，体现出活血作用。
图1 大鼠全血黏度柱状图
图2 大鼠全血相对指数柱状图
图3 大鼠全血相对指数柱状图
图4 大鼠全血相对指数柱状图
表1 各组大鼠全血黏度指标
表2 各组大鼠全血相对指数和红细胞聚集指数的影响
3.2 大鼠全血相对指数和红细胞聚集指数
3.3 各组大鼠血液中血栓素B2/6-酮前列腺素-PGF1α对比分析
结果如图5～图7所示，模型组大鼠血栓素B2含量为12.89 ng/L，6-酮前列腺素-PGF1α含量为1 302.75 ng/L，血栓素B2和6-酮前列腺素-PGF1α的比值为0.009 9，黄芪豆豉高、中、低剂量组大鼠血栓素B2含量分别为7.29，6.04和8.83 ng/L，6-酮前列腺素-PGF1α含量分别为2 079.51，2 039.93和1 880.74 ng/L，血栓素B2和6-酮前列腺素-PGF1α的比值分别为0.003 5，0.002 9和0.004 6，可见黄芪豆豉高、中、低剂量组TXB2/6-keto-PGF1α浓度相对于模型组明显减低并趋近于空白组，其中黄芪豆豉中剂量组最接近空白组水平，表明适当剂量的黄芪豆豉能降低血小板聚集性和血液黏度，从而减轻“血瘀证”，具有活血作用。
图5 各组大鼠血液中TXB2的含量
图6 各组大鼠血液中6-keto-PGF1α的含量
图7 各组大鼠血液中TXB2/6-keto-PGF1α的比值
以气虚血瘀的中医指导理论为基础，通过对试验动物采用冷水力竭游泳+限食饲养饥饿+力竭疲劳游泳的复合因素方法成功复制气虚血瘀大鼠模型。造模方法和指标检测均比较符合气虚血瘀症状，模型组大鼠因长期力竭和饥饿的条件下，气血不足，身体调养欠缺，使其体重增长缓慢，毛发凌乱无光泽，耳部、爪部及尾部发白无血色，精神萎靡。从证型角度造模更符合中医理论，较化学药物造模更适用于中药的药理学研究。
对气虚血瘀证模型大鼠的血液流变学指标进行检测有重要的意义，全血黏度表示血液总体（包含血细胞和血浆）流动性的指标。全血黏度增高表示血液黏滞性增加而流动性降低。由于血液在不同的流动状态（切变速度）下所表现的黏度是不同的，因而一般测定由高到低几种不同切变速度下的全血黏度，用以大致反映血液在体内不同粗细、不同压差的血管中的流动性。血浆黏度增加的直接原因是血浆纤维蛋白原或大分子球蛋白增加，或血脂显著增加。全血相对指数是指除去血浆黏度这个影响因素后的全血黏度，它反映血细胞浓度和血细胞本身性质对血液流动性的影响，它也有两个指标：（1）全血高切相对黏度，其增加的直接原因是血细胞浓度增加，或红细胞刚性增高（变形能力降低）；
（2）全血低切相对黏度，其增加的直接原因是血细胞浓度增加，或红细胞聚集性增加。
TXB2是TXA2的产物，而TXA2是前列腺素的一种，是由血小板产生的具有血小板凝聚及血管收缩的作用的生物活性物质，其半衰期只有30 s，产生后会迅速转化为无活性的TXB2[17]。6-keto-PGF1α是PGI2的代谢产物，而PGI2是由血管内皮细胞合成后释放出的抗血小板聚集和舒张血管的一种生物活性物质，同样地，PGI2半衰期很短，会迅速转变为稳定无活性的6-keto-PGF1α。TXA2/PGI2比值高易导致血小板聚集，血栓形成，促进动脉硬化和冠心病[18]。而通过检测稳定物质TXB2和6-keto-PGF1α的比值水平就可以间接了解TXA2和PGI2的水平。
造模给药60 d后取材时，模型组大鼠腹主动脉血液明显较其他组黏稠且已凝固，从表征指标上看，黄芪豆豉高、中剂量组优于模型组气虚血瘀大鼠，从血液流变学指标上看，黄芪豆豉高、中剂量组的数据均证明服用黄芪豆豉可以明显改善气虚血瘀大鼠的血液黏度，表明了黄芪豆豉具有益气活血作用。
猜你喜欢豆豉全血造模献血间隔期，您了解清楚了吗？人人健康(2022年13期)2022-07-25不足量全血制备去白细胞悬浮红细胞的研究*检验医学与临床(2022年1期)2022-01-26肾阳虚证动物模型建立方法及评定标准研究进展江西中医药(2021年8期)2021-08-10脾肾阳虚型骨质疏松症动物模型造模方法及模型评价世界科学技术-中医药现代化(2021年12期)2021-04-19湿热证动物模型造模方法及评价研究世界科学技术-中医药现代化(2021年12期)2021-04-19母亲的豆豉火焙鱼文苑(2018年19期)2018-11-09豆豉堪称『长寿豆』老年教育(老年大学)(2018年3期)2018-01-28应用快速全血凝集试验法诊断鸡白痢和鸡伤寒兽医导刊(2016年6期)2016-05-17不同后发酵时间的水豆豉理化特性比较研究食品工业科技(2014年11期)2014-03-11润肠通便功能试验中造模剂的选择实验动物与比较医学(2014年6期)2014-02-28