马青彬 刘芳 梁芳 邢冬飞 孙娜
摘要：为研究乳酸菌联合小球藻（Chlorella vulgaris）对褶皱臂尾轮虫（Brachionus plicatilis）种群增长的影响，以盘锦光合蟹业有限公司轮虫池冬卵孵化的轮虫为试验对象，以小球藻为轮虫基础饵料并添加不同浓度的微生态制剂乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB），设置乳酸菌的浓度梯度为0（对照组）、1×108cells/mL、2×108cells/mL、5×108cells/mL、10×108cells/mL，连续观察4d，对轮虫种群密度、抱卵率和平均增长率等进行统计。结果表明，在轮虫种群密度起始相同的情况下，添加适宜浓度的乳酸菌处理组轮虫最大种群密度、抱卵率和平均增长率是同时期对照组的3倍、3倍和5倍（P＜0.05），且能有效降低培养水体pH使其在轮虫生长适宜范围内。结果表明以小球藻为轮虫基础饵料，添加一定浓度的乳酸菌有利于褶皱臂尾轮虫的生长繁殖，可以提高轮虫的种群数量，促进种群增长。
关键词：乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）；
褶皱臂尾轮虫（Brachionus plicatilis）；
小球藻（Chlorella vulgaris）；
种群密度；
种群增长
中图分类号：S917文献标志码：A
褶皱臂尾轮虫（Brachionus plicatilis）属轮虫门，单卵巢纲，单巢目，游泳臂尾轮虫科，臂尾轮虫属[1-2]。其多数分布在盐度较高的河口和近海区域，具有适应能力强、生长快、营养丰富、大小适中、适口性好、游动缓慢等特点，可以大规模人工培养，适合作为水产动物的开口生物饵料[3]。目前，轮虫可以作为60多种海水鱼类和近20种甲壳动物的育苗活饵料。随着种苗培育密度不断提高，作为优质活饵料的海水轮虫的需求量也不断增大，能否持续高效生产轮虫，已成为种苗培育成败的关键因素。
近些年，微生态制剂也被应用于褶皱臂尾轮虫的培育工作中。有研究表明，采用小球藻液、面包酵母和光合细菌混合培育出的褶皱臂尾轮虫效果较好[4]；
杨质楠等[5]证实在饵料中添加光合细菌对轮虫有促生长作用；
甘松永[6]和肖佳华等[7]也发现了利用芽孢杆菌作为饵料培养轮虫是可行的，且有利于轮虫的生长并提高轮虫的种群数量。以往研究多是光合细菌和芽孢杆菌等在轮虫培育中的应用，而乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）用于轮虫培育的研究很少。该实验通过利用乳酸菌联合小球藻混合投喂轮虫，观察其种群增长变化，探究乳酸菌投喂轮虫的适宜浓度，为轮虫高效生产提供数据参考。
1 材料与方法
1.1 材料
褶皱臂尾轮虫由盘锦光合蟹业有限公司轮虫池冬卵提供；
培育海水为天然海水，盐度20‰；
微生态制剂乳酸菌由运城市盐湖区鸿翔水处理制药厂生产；
小球藻由盘锦光合蟹业有限公司小球藻池提供。
1.2 方法
1.2.1 轮虫孵化
用轮虫冬卵进行孵化，将轮虫卵放入装有500mL、盐度20‰的天然海水的烧瓶中，放置在生化培养箱中孵化，孵化温度25℃，时间1d。孵化完成后，选取活力较好且不带卵的轮虫按照2ind./mL的接种密度放入500mL烧杯中进行实验。
1.2.2 乳酸菌发酵
实验前，先将乳酸菌进行培养。乳酸菌培养方法：称取1.25g菌粉、15g红糖充分溶解到500mL蒸馏水中，培养温度25℃，发酵1d后，测量pH在3～4之间可用，显微镜下血球计数板定量乳酸菌浓度为5×107 cells/mL。
1.2.3 试验设计
将15个500mL烧杯分成5个实验组，每组3个平行。每个烧杯均添加定量的小球藻，不同的乳酸菌添加量，混合均匀，在不充气、不换水、水温控制在25℃、光照正常条件下进行培养。每24hrs对烧杯中轮虫种群进行取样计数，计算轮虫抱卵率P和平均增长率R，并检测其培养水体的水化指标。分组情况见表1。
1.2.4 种群增长相关的测定
每24hrs从每一个烧杯中随机吸取1.0mL轮虫培养液，加碘液固定后计数每毫升培养液轮虫数量、轮虫卵数，重复3次。
1.2.5 培养水体水化指标的测定
用pH计测定培养水体pH，每一个烧杯测3次，取平均值。用便携溶氧仪测定水体溶解氧。
1.2.6 试验计算
平均增长率R：
N0表示实验初始轮虫种群密度；
Nt表示实验结束时轮虫种群密度；
t表示试验天数。
轮虫抱卵率P＝（轮虫卵的总数/轮虫总数）×100％
1.3 统计分析
应用单因素方差分析（One-way ANOVA）比较各试验组的种群密度、抱卵率、平均增长率及水化指标值的差异显著性；
用Duncan多重比较检验对比各处理间的均值，差异显著性水平（P）值设为0.05，结果采用“均值±标准误”表示。采用IBM SPSS Statistics 20.0统计软件进行统计。
2 结果
2.1 乳酸菌联合小球藻对轮虫种群密度的影响
乳酸菌联合小球藻投喂轮虫对其种群密度的影响变化见图1。结果显示，在轮虫种群起始密度相同的情况下，从开始到培养结束，各个实验组均有不同程度的种群密度增加，其中处理组D在培养时期种群密度都高于其他实验组，而處理组E在培养后期阶段种群密度明显小于其他实验组。培养1d时，处理组D与其他组之间差异显著（P＜0.05），种群密度明显高于其他实验组，处理组B、C、E与对照组A之间差异不显著（P＞0.05），种群密度相当；
培养2d时，处理组B、C、D、E与对照组A之间差异显著（P＜0.05），处理组较对照组都有明显的种群密度增多，其中处理组D与其他实验组有明显的差异显著（P＜0.05），其种群密度是同时期对照组A的3倍左右；
培养3d时，处理组D与其他实验组之间差异显著（P＜0.05），是同时期对照组A种群密度的2.5倍左右，而处理组E的种群密度已经低于其他实验组；
培养4d时，处理组B、C、D、E之间差异显著（P＜0.05），对照组A和处理组E之间也差异显著（P＜0.05），且处理组E种群密度远低于对照组A，照组A和处理组B之间差异不显著（P＞0.05），且种群密度接近。
2.2 乳酸菌联合小球藻对轮虫种群抱卵率的影响
乳酸菌联合小球藻投喂轮虫对其种群抱卵率的影响变化见图2。结果显示，在种群起始密度均等的情况下，对照组和处理组的种群抱卵率整体都是呈上升然后下降趋势，其中处理组D的种群抱卵率在培养期间明显高于其他实验组。培养1d时，处理组C、D、E与对照组A之间差异显著（P＜0.05），处理组D的种群抱卵率是对照组A的2.5倍，且在同时期的实验组中抱卵率最高达到60%，处理组B和对照组A种群抱卵率相当；
培养2d时，处理组D与其他实验组之间差异显著（P＜0.05），其种群抱卵率达到80%，是同时期其他实验组的2倍；
培养3d时，处理组D抱卵率达到最高值，在130%左右，是对照组A的3倍左右，其余处理组种群抱卵率也比对照组要高；
培养4d时，实验组出都现了不同程度的种群抱卵率下降，但处理组D的抱卵率还是最高的。
2.3 乳酸菌联合小球藻对轮虫种群平均增长率的影响
乳酸菌联合小球藻投喂轮虫对其种群平均增长率的影响变化见图3。结果显示，在种群起始密度均等的情况下，不同乳酸菌接入量的实验组其种群平均增长率也不同，但整体呈上升趋势。处理组D相比较其他实验组有明显的增长趋势，而处理组E随着培养进行到后期，其种群平均增长率明显低于其他实验组。培养1d时，处理组D与其他实验组之间差异显著（P＜0.05），且平均增长率明显高于其他组太多，接近60%，是处理组B、C、E平均的2.5倍，是对照组平均正常率的5倍；
培养2d时，处理组与对照组之间差异显著（P＜0.05），且处理组D与其他组之间也差异显著（P＜0.05），平均增长率达到80%，是对照组的2.5倍左右；
培养3d时，处理组D平均增长率趋近平缓，处理组E增长出现缓慢，其平均增长率小于其他对照组、远小于其他处理组；
培养4d时，处理组平均增长率无明显增长，趋近平缓。处理组D与其他实验组之间相互都差异显著（P＜0.05），平均增长率处于最高值在80%以上。
2.4 乳酸菌联合小球藻对轮虫培养水体pH值的影响
乳酸菌联合小球藻对轮虫培养水体pH的影响变化见图4。结果显示，由于乳酸菌为酸性物质，其实添加量决定其起始pH，乳酸菌加入量多对应其实验组pH更低，按pH从大到小依次是对照组A、处理组B、处理组C、处理组D、处理组E。培养4d后，所有实验组整体pH都出现了不同程度的升高。在1d培养后，对照组A出现小幅度的升高，其他实验组都出现不同程度的升高，其中处理组E升高最多到8.0左右，处理组E从5.8升高到7.8。在之后的3d培养中，对照组A升高程度趋近平缓数值在10.0以上；
处理组B和C升高程度相似均达到9.5以上；
处理组D升高到9左右；
处理组E一直在8.5以下。
2.5 乳酸菌联合小球藻对轮虫培养水体溶解氧的影响
乳酸菌联合小球藻对轮虫培养水体溶解氧的影响变化见图5。结果显示，随着培养的进行，实验组溶解氧均出现了下降，其中处理组E下降最快，最低值已经低于5.0mg/L。在第1d培养后，除实验组E下降其他实验组均升高，溶解氧均在18mg/L以上。培养2d时，处理组B、C、D与对照组A和处理组E之间差异显著（P＜0.05），处理组E已下降10mg/L以下。培养第3d和第4d，各实验组溶解氧均出现降低，处理组E下降最多，到第4d时下降到5.0mg/L以下，其他实验组均在10mg/L左右。
3 讨论
目前在轮虫的高密度培养中，微藻类作为主要生物饵料，其中小球藻是适合轮虫大规模培育的优质饵料，它虽含有轮虫生长所需的某些非必需氨基酸和脂肪酸[8]，但因单一藻类的营养价值有限，不能更高效地生产轮虫，随之微生态制剂与藻类的搭配的研究也逐渐增多。该试验对微生态制剂乳酸菌联合小球藻投喂轮虫进行研究。试验结果表明，在小球藻作为主体饵料浓度一定的情况下，添加适量的乳酸菌可促进褶皱臂尾轮虫种群增长，而且效果显著。
在轮虫种群培育阶段，有充足的营养物质会对其种群增长起到至关重要的作用[9]。该实验通过添加不同接入量的乳酸菌和小球藻混合进行投喂轮虫，发现处理组D在种群密度、抱卵率、平均增长率上都优于其他实验组。由于处理组E添加了过量的乳酸菌，对种群培养产生了很大的不利影響，导致其从第2d培育时就比其他处理组和对照组在种群密度、抱卵率、平均增长率明显的下降，因此过量的乳酸菌量添加，不仅没有帮助改善水体环境和轮虫生长，反而抑制了轮虫种群增长；
而处理组B、C、D较对照组A都出现了明显的种群密度增长，随着乳酸菌添加量的升高，其对轮虫种群增长起到的助力更多，其中处理组D是在同一培育时期对照组A的种群密度的3倍。分析其原因，乳酸菌本身通过繁殖可产生大量的蛋白质、氨基酸和各类维生素等营养元素[10]，而且部分代谢营养元素已经被证实可对轮虫生长繁殖产生有益影响[11]，王金秋等也证实了在酵母中添加了维生素C用其培养轮虫可显著提高轮虫种群增长率[12]。
轮虫培育不仅需要充足的营养，还同样也需要一个好的水体环境，才能更好地生长。有研究证实褶皱臂尾轮虫培养的适宜pH值为5～9，但pH在8～9范围内增长快[13]。该次实验处理组D在培育期间pH变化范围为8.0～9.5之间，pH都在一个适宜轮虫培育的区间，其抱卵量是同时期对照组的3倍，而其余实验组的pH都或高或低，对轮虫的种群增长效果都不如处理组D，可见适量的乳酸菌会提高轮虫的产量，利于其种群增长。分析其原因，在正常的轮虫培育中，由于海水小球藻大量繁殖，通过光合作用吸收CO2，释放O2气，使得培育水体的pH偏高，显碱性，有时pH都在10.2以上，这种情况很不利于轮虫种群增长和抱卵，抑制其种群发展，而发酵好的乳酸菌制剂pH在3.0～4.0之间，显酸性，通过酸碱中和，在小球藻中加入适量的乳酸菌制剂，使得轮虫培育水体pH在一个较适合轮虫培育的一个区间，故能使其种群增长。同样乳酸菌自身产生物质可以降低水体中的亚硝酸盐、氨氮和硫化氢浓度，还可以对水体生物残留物、池底沉积的排泄物、残饵等有机废物进行分解[14]，为轮虫培育生长提供一个良好的水环境。盖建军等也研究证实在亚硝酸盐浓度较高的水产培育水体中使用芽孢杆菌制剂和乳酸菌制剂，能够有效地降低亚硝酸盐对水生动物的危害[15]。
對轮虫培育水体中溶解氧来说，只要水体中不缺氧，对轮虫的培育不会影响。该实验中，处理组B、C、D在培育期间，水体溶解氧没有明显的下降，对其轮虫种群增长影响较小，而处理组E加入了过量的乳酸菌，导致水体溶解氧直线下降，进而导致其轮虫种群增长受到抑制。说明只有适量的乳酸菌浓度才能对轮虫种群增长起到关键作用。故在轮虫培育中在小球藻培养水体中添加适量的乳酸菌可以改善培养水体环境，促进褶皱臂尾轮虫的种群增长。
4 问题与展望
轮虫种群生长受饵料种类和环境因子影响，其培育条件和饵料供应已有大量研究，但利用微生态制剂乳酸菌加快轮虫种群增长的报道较少。该试验证实了添加适量的乳酸菌能明显增强轮虫种群增长，但是最适的添加比例以及乳酸菌促进轮虫种群增长的协同作用机理等还需要进一步研究。
该试验在实验室理想状态下进行，乳酸菌受到其他菌株影响很小，如果在室外大面积水体高密度培养过程中，培养水体易受周围环境影响，导致水体中菌落生态较复杂，如何在大水体环境下确保浓度与活菌数是生产中的关键，这也是以后的研究方向。
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Effect of lactic acid bacteria in combination with Chlorella vulgaris on the population growth of Brachionus plicatilis
MA Qingbin， LIU Fang， LIANG Fang， XING Dongfei， SUN Na
（Panjin Photosynthetic Crab Industry Co.， Ltd.， Panjin 124200， Liaoning China）
Abstract：In order to study the effect of Lactic acid bacteria in combination with Chlorella vulgaris on the population growth of Brachionus plicatilis， the rotifers hatched from the rotifer pond of Panjin Guanghe Crab Industry Co.， Ltd.were used as the test object， and and C. vulgaris was used as the rotifer base bait with different concentrations of probiotics Lactic acid bacteria. The concentration gradients of Lactic acid bacteria were 0 cells/mL， 1×108cells/mL， 2×108cells/mL， 5×108cells/mL and 10×108cells/mL， the rotifer population density， egg-holding rate， average growth rate and so on were observed for 4 days and the data were counted. The results showed that when the population density of rotifers was the same， the maximum population density， egg-holding rate and average growth rate of rotifers in the group treated with appropriate concentrations of lactic acid bacteria were three times， three times and five times higher than those in the control group at the same period （P<0.05）， and the pH of the culture water was effectively reduced to a suitable range for rotifer growth. And with C. vulgaris as the rotifer base bait， the addition of certain concentration of lactic acid bacteria is beneficial to the growth and reproduction of B. plicatilis， which can increase the population size of rotifers and promote the population growth.
Keywords：lactic acid bacteria; Brachionus plicatilis; Chlorella vulgaris; population density; population growth
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