李国梁,周晓倩,唐焕峰,王 玮,陈克正
(青岛科技大学 材料科学与工程学院,山东 青岛 266042)
随着抗生素的滥用,引起了细菌多重耐药性,大大削弱了传统抗生素的治疗效果。据统计,大多数致死性细菌感染是由耐药菌引起的[1]。研究发现,与耐药菌有关的感染通常表现出对抗生素有较强的抵抗力和不敏感性。细胞壁和细胞膜作为细菌的屏障,可保护细菌免受各种抗菌剂的侵害,有证据表明,抗菌剂吸收的增加可提高抗菌效率[2]。快速膜穿透的材料便可以跨越这道保护屏障,穿透细胞壁、细胞膜,直接进入细菌内部,破坏膜的调节功能,进而使蛋白质和DNA/RNA分子失活[3-4]。到目前为止,已经开发出了几种抗菌剂[5],基于带正电的试剂和带负电的膜之间的静电吸引,采用阳离子策略通过细菌策略转移到细菌的细胞膜上。但是,阳离子化合物会引起哺乳动物细胞膜的破坏,较高的细胞毒性限制了其应用。生物相容性好、能够穿透膜结构的材料便可解决该问题,并且目前有关材料能够穿膜进行抗菌的报道比较少见。
光热抗菌剂(PTA)被认为是最潜在的抗菌策略之一。许多文献已经证明,从光能转换而来的热量可以抑制多药耐药细菌的生长[6]。更重要的,近红外光具有高组织渗透性以及可忽略不计的热损伤等特点[7]。聚噻吩(PEDOT)是一种众所周知的聚合物光热材料,具有良好的生物相容性和可降解性,因此在临床上具有更好的应用前景。目前报道的聚合物基光热材料大多是非水溶性的纳米颗粒,在用于体内治疗之前需要进行复杂的表面修饰,使材料的光热性能、生物相容性受到限制。制备水溶性聚合物虽然采用天然的氧化还原酶做催化剂可以解决这一问题,但天然酶易变性、不稳定等缺点严重限制了这一制备工艺的发展。而磷酸铜纳米酶(CuPOs)具有高催化活性,且结构简单,耐酸耐碱、稳定性好,克服了传统模拟酶合成复杂、提纯困难和对环境敏感的问题。
本研究从开发快速、高效、副作用最小的抗菌方案的角度出发,报道了一种对于生物系统相容性至关重要的酶模拟水合成方法,以磷酸铜(CuPOs)纳米酶为催化剂,3,4-乙烯二氧噻吩(3,4-ethoxylene dioxy thiophene,EDOT)为单体,聚苯乙烯磺酸钠(PSS)为模板,双氧水为引发剂,评价了水溶性PEDOT:PSS的绿色合成及其抗菌应用研究。
1.1 试剂与仪器
3,4-乙烯二氧噻吩(3,4-ethylenedioxythiophene,EDOT),聚苯乙烯磺酸钠(poly(p-styrenesulfonic acid),PSS),尿素(H2NCONH2),乙醇,二甲苯,硫酸铜(CuSO4·5H2O),磷酸(H3PO4),磷酸氢二钠十二水合物(Na2HPO4·12 H2O),柠檬酸一水合物(C6H8O7·H2O),H2O2(30%)等购自西格玛实试剂公司;二甲基亚砜(DMSO),琼脂,酵母提取物,胰蛋白胨等购自Bodi Chemical Co.,Ltd(中国天津)。
高压反应釜,170 m L,上海安谱科学仪器有限公司;恒温箱,SX2-X-16系列,济南精密科学仪器有限公司;高速离心机(TG/16G),天津市奥特赛恩斯仪器厂;全波长酶标仪(FLASH),美国赛默飞世尔科技公司;紫外-可见-近红外分光光度计(UV-Vis-NIR),TU-1810型,北京普析通用仪器有限责任公司;共聚焦荧光显微镜(CLSM),ECLIPSE Ti2-E型,日本Nikon公司;荧光分光光度计,F4600型,日本Hitachi公司;近红外热成像相机,Ti200型,美国Fluke公司。
1.2 水溶性PEDOT:PSS的合成
1.2.1 CuPOs纳米酶的制备
取尿素(H2NCONH2)6.000 g,置于250 m L烧杯中,加入84 m L超纯水搅拌至溶解;称取0.050 g十二烷基硫酸钠(SDS)于溶液中,搅拌10 min;取0.125 g五水合硫酸铜(CuSO4·5 H2O)溶于8 m L超纯水搅拌10 min后;0.049 g磷酸(20%(质量分数)H3PO4)溶于8 m L超纯水加入其中搅拌1 h;将溶液迅速移至150 m L高压反应釜;80℃恒温反应2 h;室温冷却1 h,将产物离心,先用超纯水、后用无水乙醇分别洗涤3遍;将沉淀物60℃干燥24 h,得到最终产物CuPOs纳米酶。
1.2.2 水溶性PEDOT:PSS的制备
取柠檬酸(19.2 m L,0.1 mol·L－1)与磷酸氢二钠(0.8 m L,0.2 mol·L－1)的缓冲液(p H＝2.2)于50 m L烧杯,加入124.0 mg的聚苯乙烯磺酸钠(PSS)搅 拌30 min;加 入87.0 mg噻 吩 单 体(EDOT)搅拌1 h;加入5.0 mg Cu POs纳米酶,将612μL双氧水(1.0 mol·L－1)逐滴滴加于上述溶液中;60℃恒温水浴24 h,产品经透析膜(cutoff KDa为8 000～14 000)透析48 h;将透析完成的产物置于温度为60℃的鼓风干燥箱中烘干,得到水溶性PEDOT:PSS。
1.3 水溶性PEDOT:PSS的性能表征
1.3.1 荧光表征
在室温下,配制0.5 mg·m L－1PEDOT:PSS水溶液,使用荧光分光光度计,通过808 nm二极管激光器作为激发源,进行荧光性能测量。
近日，从全国工商联组织工作会议上传来消息，云南省昆明市官渡区工商联连续第二次被评为全国“五好”县级工商联。全国“五好”县级工商联是官渡区围绕“领导班子好、会员发展好、商会建设好、作用发挥好、工作保障好”等五个方面努力得到的成果，尤其是多措并举为会员企业**融资难题获得一致赞誉。
1.3.2 光热升温性能表征
1)将不同浓度的材料水溶液(500μL,0、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 mg·mL－1)加入1.5 mL EP管中,进行近红外激光照射(808 nm,1.5 W·cm－2,5 min)。每隔20 s,用近红外热成像相机记录溶液的温度,并将升温数据绘制成升温曲线。
2)将不同浓度的材料水溶液(500μL,0、0.1、0.2、0.5 mg·m L－1)加入1.5 m L EP管中,分别进行不同功率密度的近红外激光照射(808 nm,0.33、0.75、1.00、1.50 W·cm－2,5 min)。用近红外热成像相机记录溶液被照射5 min后的最终温度。
1.3.3 光热循环稳定性及光热转换效率评价
取0.4 m L H2O于1.5 m L EP管 中,称 量H2O的 净 重,用 近 红 外 激 光(808 nm,1.0 W·cm－2,5 min)照射5 min后,在正常条件下冷却至室温。在此期间,每20 s记录一次EP管的实时温度。然后在相同实验条件下,用近红外激光(808 nm,1.0 W·cm－2,5 min)照射材料水溶液(0.4 m L,2.0 mg·m L－1),重复5次,每次都需对溶液净重进行测量,最后根据升温降温数据绘制时间-温度曲线。
最后,根据绘制的时间-温度曲线,并通过公式计算材料的光热转换效率[8]:
其中,η是材料的光热转换效率,Tmax是溶液通过升温所能达到的最高温度,Tsurr是溶液实验过程的环境温度,A808是材料水溶液在808 nm处的吸光度,Qdis是溶液在升温过程中与环境热交换消耗的热量,C是水的比热容,m是实验过程中溶液的净重,T是实验过程中溶液的实时温度,τs为材料溶液降温曲线拟合直线的斜率,I为近红外激光器的功率密度。
收集Wistar大鼠动脉血(来自心脏或腹主动脉的血液),并加入肝素抗凝。将抗凝血3 000 r·min－1、4℃环境下离心5 min后获得红细胞,用PBS洗涤3次后,配制一定体积5%红细胞悬液待用。制备500μL不同浓度(0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 mg·m L－1)的样品溶液,以PBS作为阴性对照,以1% Triton X100作为阳性对照,分别与500μL 5%红细胞悬液混匀。将混合物在37℃下孵育3～4 h,离心分离并留存照片,并测定上清液在540、570 nm的OD值。参考以下公式计算溶血率x(由于样品在540、570 nm处有吸收,故设置对应空白材料组以除去材料吸收对实验的影响):
1.4 水溶性PEDOT:PSS的抗菌性能评价
细菌选用革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(S.aureus)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)为实验模型,培养实验过程需要细菌操作间和洁净台及主要器械耗材的消毒。
1.4.1 荧光共定位
孵育细菌MRSA过夜;次日,将摇好的菌液用PBS洗涤后,利用LB培养基将细菌悬液浓缩至4×109CFU·m L－1(OD600＝4),与PEDOT:PSS(0.2 mg·m L－1)共孵育30 min;PBS离心洗涤3次去除残留的PEDOT:PSS,用DAPI溶液(1.0 m L,10 μg·m L－1)室温重悬5 min;最后用PBS洗涤2次,进行共聚焦成像。
1.4.2 平板计数
1)将制备的浓度为109CFU·m L－1(OD600＝1)的细菌悬液随机分为4组:“Control”“NIR-only”“PEDOT:PSS-only”和“PEDOT:PSS＋NIR”;
2)依次加入125μL PBS、125μL PBS、125μL PEDOT:PSS(1 mg·m L－1)、125μL PEDOT:PSS(1 mg·m L－1),然后加入菌液至500μL,依次命名为“Control”“NIR-only”“PEDOT:PSS-only”和“PEDOT:PSS＋NIR”,摇床摇幌30 min,将“NIRonly”“PEDOT:PSS＋NIR”组取出进行近红外激光照射(808 nm,1.0 W·cm－2,5 min)后孵育2 h。
3)细菌涂板:将共孵育菌液用PBS稀释10万倍(10×10×20×50稀释),取100μL稀释后的菌液于培养皿中心位置,并用灭菌三角形涂板棒将菌液涂抹均匀(设置3组平行试验)。最后做好标记将培养皿倒置于37℃恒温孵箱静置培养。
4)菌落计数:待固体培养基上长出单克隆菌落后,使用化学发光成像仪对菌落记录,并对每个培养皿中的单克隆菌落数量进行计算。
2.1 水溶性PEDOT:PSS红外光谱分析
PEDOT:PSS的合成示意图见图1。
图1 PEDOT:PSS的合成示意图Fig.1 Schematic diagram of the synthesis of PEDOT:PSS
如图2(a)所示,产物在CuPOs纳米酶的催化条件下成功合成,并在808 nm处有强吸收。另外,由图2(b)可知,产物在3 442 cm－1处有非常强的吸收峰,是由产物的水分中的－OH伸缩振动产生的;在2 925 cm－1处的吸收峰为EDOT中CH2的伸缩振动造成的;1 604 cm－1处的吸收峰为苯环中的骨架振动引起的;1 185、1 129 cm－1处的吸收峰为EDOT中C－O键的伸缩振动造成的;1 041、1 009和939 cm－1处的吸收峰是C－O－C键的对称伸缩振动;775、673和518 cm－1处的吸收峰为C－S键的伸缩振动导致。综上,证明了水溶性聚合物PEDOT:PSS的成功合成。
图2 有无CuPOs纳米酶催化条件下产物的紫外-可见-近红外吸收和PEDOT:PSS的红外谱图Fig.2 UV-Vis-NIR absorption of the product with or without CuPOs nanoenzyme catalysis and the infrared spectrum of PEDOT:PSS
2.2 水溶性PEDOT:PSS光热升温性能评价
为了进一步验证所合成的水溶性PEDOT:PSS的光热性能,评价了不同浓度的PEDOT:PSS溶液(0、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 mg·m L－1)在近红外激光照射(808 nm,1.00 W·cm－2,5 min)后的升温情况,结果见图3。从图3(a)可以看出,PBS溶液经过5 min照射后,温度始终维持在25.9℃;当PEDOT:PSS浓度为0.05 mg·m L－1时,最高温度就可达51.4℃,具有良好的光热升温效果,可对材料能否应用于光热抗菌领域进行进一步研究;当PEDOT:PSS浓度为0.50 mg·mL－1时,升温高达82℃;然而当浓度继续升高时,发现温度的上升受到限制,猜测其原因可能是溶液与环境强烈的热交换限制了其温度的进一步升高。另外又对不同浓度(0.1、0.2、0.5 mg·m L－1)的PEDOT:PSS进行了在不同功率密度(0.33、0.75、1.00、1.50 W·cm－2)照射5 min后的升温情况评价,如图3(b)所示,进一步说明了水溶性PEDOT:PSS优异的光热升温效果,后续抗菌实验选用浓度为0.2 mg·m L－1的PEDOT:PSS水溶液,照射参数为808 nm,1.50 W·cm－2,5 min。
图3 不同浓度PEDOT:PSS在不同条件下的升温曲线及最终温度Fig.3 Heating curve and final temperature of different concentrations of PEDOT:PSS under different conditions
2.3 水溶性PEDOT:PSS光热循环稳定性及光热转换效率评价
光热材料不仅仅需要具有良好的光热升温效果,还需要具有良好的光热循环稳定性、转换效率等,才能更有利于应用于光热抗菌领域。因此,本研究进一步评价了PEDOT:PSS的光热循环稳定性、转换效率,结果见图4。对浓度为2.00 mg·m L－1的水溶性PEDOT:PSS的水溶液进行了5次升温循环,近红外激光照射(808 nm,1.00 W·cm－2,5 min)后均能达到80℃左右,具有良好的光热循环稳定性。同时,经过计算,PEDOT:PSS的光热转换效率高达46.4%,具有优异的光热转换效率。
图4 PEDOT:PSS的升温循环曲线及光热转换效率Fig.4 Heating cycle curves and photothermal conversion efficiency of PEDOT:PSS
2.4 水溶性PEDOT:PSS生物相容性评价
水溶性PEDOT:PSS对于宿主来说始终是异物,可能会产生一些排异反应,因此,其生物相容性评价至关重要,溶血率低于3%被认为是不溶血的、生物相容性好的[9]。图5为不同浓度下PEDOT:PSS的溶血率。即使PEDOT:PSS的浓度为1.00 mg·m L－1时,溶血率仅为4.59%±0.14%,可以认为溶血率很低,而剂量在0.50 mg·m L－1时,溶血率仅为1.83%±0.13%,表明了合成的水溶性PEDOT:PSS具有良好的生物安全性。
图5 不同浓度下PEDOT:PSS的溶血率Fig.5 Hemolysis rate of PEDOT:PSS under gradient concentration
2.5 水溶性PEDOT:PSS光热抗菌评价
将MRSA与水溶性PEDOT:PSS溶液共孵育5、30、120 min后的荧光共定位,如图6所示。红色荧光代表细菌,绿色荧光代表PEDOT:PSS,发现共孵育5 min时,PEDOT:PSS所发出的绿色荧光已被红色荧光所包含,证明了PEDOT:PSS能够在5 min时很快地进去细菌内部,证明合成的水溶性PEDOT:PSS优异的穿膜性质。由于蛋白质在高于60～70℃环境下就会变质[7],而PEDOT:PSS光热升温能达到78.467℃,材料穿膜后再结合激光照射,所产生的热量将会直接在细菌内部对生命活性分子如蛋白质等造成十分严重的不可逆热损伤,从而大大提升PEDOT:PSS的光热抗菌效率。
图6 DAPI染色的MRSA与PEDOT:PSS共孵育5、30和120 min的CLSM图像Fig.6 CLSM images of DAPI-stained MRSA co-incubated with PEDOT:PSS for 5,30 and 120 min
对于水溶性PEDOT:PSS的抗菌评价,采用了平板计数法研究其对MRSA、S.aureus的光热抗菌活性,如图7所示。与“Control”组相比,未添加PEDOT∶PSS,仅用NIR细菌存活率出现上升,表明NIR对细菌的生长具有一定的促进作用;“PEDOT:PSS-only”组细菌存活率没有明显变化,表明材料本身对细菌没有毒性;而“PEDOT:PSS＋NIR”组的抗菌效果明显,菌落数量显著降低,MRSA的生存率:仅为0.97%±0.56%,S.aureus的生存率:仅为0.06%±0.10%,表明材料因光热升温对细菌造成了严重破坏,光热抗菌效果显著。进一步验证了水溶性PEDOT:PSS应用于光热抗菌领域的巨大潜力。
图7 PEDOT:PSS光热治疗细菌S.aureus、MRSA的平板克隆及量化Fig.7 Plate cloning and quantification of PEDOT:PSS photothermal treatment of S.aureus and MRSA
实验合成的水溶性聚合物PEDOT:PSS能将光能高效的转化为热能,光热转换效率高达46.4%;剂 量 在0.5 mg·m L－1时,溶 血 率 仅 为1.83%±0.13%,表明材料具有良好的生物安全性;能有效通过跨膜穿透细菌膜结构进去细菌内部,光热抗菌评价实验表明材料光热抗菌效果显著,验证了水溶性聚合物PEDOT:PSS应用于光热抗菌领域的巨大潜力。
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