★陈阳 高慧 熊晓莉 雍蕾 金镭 丁艳 邓婕 叶喜德(.南昌大学第二附属医院 南昌 0006;
. 江西中医药大学 南昌 0004;
. 中国人民解放军联勤保障部队第九〇一医院药剂科 合肥 00)
阿尔茨海默病(Alzheimer"s disease,AD)是一种好发于中老年阶段、呈进行性发展的中枢神经系统退行性疾病[1],中医把AD归属于“痴呆”“善忘”等范畴。远志,为益智之良药,也是治疗AD常用中药。早在《神农本草经》便有“益智慧,不忘,强志”等记载。现代研究表明,远志中可通过调控异常tau蛋白、改善胆碱能系统、抗氧化、抑制细胞凋亡等多途径、多靶点而发挥抗痴呆、提高智力作用,其中皂苷和寡糖酯类成分是其主要药效物质基础[2-3]。
“建昌帮”是江西地方中药炮制传统流派,炆远志为“建昌帮”特色中药饮片,收载于2008年版《江西省中药饮片炮制规范》。该法以甘草为辅料,以陶坛砂罐为容器,糠火烧四边,于文火慢煮,即为炆法。远志经炆制后,不仅可缓和燥性,还能增强益智安神之效[4-5]。前期基础表明,远志经炆制后化学成分含量及种类均发生了明显变化[6]。由于成分是药效变化的关键因素,所以炮制后的成分变化势必影响药效。但截至目前,炆远志炮制前后对益智药效发生变化,文献研究仍属空白。从痴呆研究来看,东莨菪碱模型可以模拟AD胆碱能系统受损,其机制在于阻断乙酰胆碱与 M 受体结合,从而抑制大脑信息的传递,干扰短时记忆的形成,该模型可用于药物治疗AD的药效及机制研究[7]。基于此,本研究以炆远志为研究对象,采用腹腔注射东莨菪碱以复制小鼠学习记忆障碍模型,研究远志经炆后对益智药效作用变化的影响,以便为远志炮制后作用变化机理提供理论依据。
1.1 仪器
FA1004N电子天平(万分之一,上海精密科学仪器有限公司);
OSB-2200旋转蒸发仪(厦门精艺兴业科技有限公司);
LGJ-10真空冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司);
Morris 水迷宫仪(上海欣软信息科技有限公司);
JY96-11N超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技有限公司);
Neofuge 13R高速冷冻离心机(上海力申科学仪器有限公司);
THZ-92C气浴恒温振荡器(上海博讯实业有限公司);
Varioskan Flash多功能酶标仪(美国赛默飞世尔科技公司)。
1.2 药物与试剂
远志药材购于山西汉广中药材加工有限公司,甘草购于安徽汇仁堂中药饮片有限公司,经江西中医药大学龚千峰教授鉴定分别为远志科植物远志Polygala tenuifoliaWilld.干燥根、豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根及根茎。
氢溴酸东莨菪碱注射液(批号62101101,遂成药业股份有限公司);
盐酸多奈哌齐片(批号21010004,重庆植恩药业有限公司);
BCA蛋白定量试剂盒(批号20210602)、超氧化物歧化酶(SOD)与丙二醛(MDA)试剂盒(批号均为20210402),均购自南京建成生物工程研究所;
乙酰胆碱(ACH)、乙酰胆碱酯酶(AChE)与乙酰胆碱转移酶(ChAT) ELISA试剂盒(批号均为202104,上海泛柯实业有限公司)。
1.3 实验动物
SPF级昆明小鼠80只,雄性,体质量(24±2)g,8周龄,购于江西中医药大学实验动物科技中心,动物许可证号:SCXK(赣)2018-0003。适应性喂养1周,动物自由进食,饮水。本研究涉及的动物实验经江西中医药大学研究伦理委员会审查批准,批准号JZLLSC20220493。
2.1 炮制品的制备
2.1.1 生远志 按2020年版《中国药典》炮制方法制备[8],除去杂质,略洗,润透,切断,干燥。
2.1.2 甘草制远志 按2020年版《中国药典》炮制方法制备[8],取甘草60 g,加适量水煎汤,去渣,加入净远志1 kg,用文火煮至汤吸尽,取出干燥。本品表面呈淡棕色。
2.1.3 炆远志 按2008年版《江西省饮片炮制规范》炮制方法制备[9],取净甘草60 g,切段,打扁,与净远志1 kg搅匀,置炆药坛内,加适量40 ℃温水 (以平药面为度);
将坛移置围灶内,坛四周堆适量谷糠,点火,液面保持沸腾炆制5 h,起坛,捡去甘草,干燥。
2.2 药液的制备
取各样品粉末适量,分别加10,8,8倍量50%甲醇回流提取3次,每次1 h,合并3次滤液,减压浓缩至一定体积后冷冻干燥成冻干粉,加蒸馏水溶解,制备成一定浓度的药液。
2.3 分组、造模及给药
适应性喂养1周后,将80只小鼠随机分为8组,每组10只,分别为模型组、空白组、阳性组(3 mg/kg)、生远志组(5.2 g/kg)、甘草制远志组(5.2 g/kg)、炆远志高、中、低剂量组(5.2、2.6、1.3 g/kg),约为临床用量的1倍、2倍、4倍。参照文献造模与给药方法[10],模型组、空白组给予生理盐水,阳性组给予盐酸多奈哌齐片,给药组给予相应剂量的药液,每天灌胃1次,连续10 d。第10天起,给药1 h后,除空白组外的各组均腹腔注射东莨菪碱2 mg/kg,空白组则腹腔注射等体积的生理盐水,30 min后进行水迷宫实验,直到第14天。
2.4 Morris水迷宫实验
迷宫直径120 cm,高36 cm,水深24 cm,黑色圆形平台(直径9 cm)置于第I象限中央,低于水面1 cm,水温为22~25 ℃。参照文献方法[11]略作修改,Morris水迷宫实验共5 d,前4天为定位航行实验,小鼠每天分别从第Ⅰ、Ⅱ、III、Ⅳ象限中点4个入水点面向池壁入水,每天练习4次,两次训练时间间隔15~20 min,每次60 s,若小鼠在60 s内找到平台,则使其在平台上停留10 s,并记录小鼠从入水到找到平台所需的时间,作为逃避潜伏期;
若小鼠在60 s内未找到平台,引导其至平台并停留10 s,将其逃避潜伏期记为60 s。最后1天为空间探索实验,撤掉平台,小鼠从第III象限入水,自由游泳持续时间60 s,观察小鼠游泳速度、在平台所在象限的停留时间、路程百分比以及穿越平台次数,并记录小鼠游泳轨迹。
2.5 脑组织中胆碱能系统指标与氧化应激指标测定
水迷宫实验结束,小鼠摘眼球取血,颈椎脱臼法处死,并迅速剥离脑组织(去除小脑),用预冷的生理盐水洗净,滤纸拭干,称重,加入9倍生理盐水冰浴上匀浆,制成10%脑组织匀浆液。4 ℃离心10 min(3 000 r/min),取上清液,分别按照试剂盒说明书的操作步骤对胆碱能系统指标(ACH、AChE、ChAT)与氧化系统指标(MDA、SOD)进行测定。
2.6 统计学方法
实验数据运用SPSS 21.0统计软件进行分析,数据用均值±标准差(±s)表示,逃避潜伏期数据采用重复测量设计的方差分析,并对每组在各个时间点进行两两比较,其余数据采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
3.1 Morris水迷宫实验结果
对于定位航行实验,对8组小鼠的逃避潜伏期进行重复测量方差分析,其中各组时间差异具有统计学意义(P<0.05),表明小鼠逃避潜伏期有随时间变化的趋势,各组组间效应也具有统计学意义(P<0.05)。组间两两比较显示,第1天训练中各组小鼠逃避潜伏期差异无统计学意义(P>0.05)。第2天训练中,与模型组比较,各给药组小鼠的逃避潜伏期虽有所缩短,差异不具统计学意义(P>0.05)。在第3、4天训练中,与空白组比较,模型组逃避潜伏期明显延长(P<0.05或P<0.01);
与模型组相比,第3天训练中的生远志组、炆远志低、中、高剂量组的小鼠逃避潜伏期均明显缩短(P<0.05),而阳性组与炆远志中剂量组虽缩短,但差异无统计学意义(P<0.05);
第4天训练中的各给药组小鼠逃避潜伏期均明显缩短,其中炆远志高剂量组与制远志组差异具明显统计学意义(P<0.01)。见表1。
表1 小鼠水迷宫定位航行逃避潜伏期(±s,n=10) s
表1 小鼠水迷宫定位航行逃避潜伏期(±s,n=10) s
注:与空白组比较,##P<0.01,#P<0.05;
与模型组比较,**P<0.01,*P<0.05。
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对于空间探索:对于游泳速度,各组间差异不具统计学意义(P>0.05)。对于原平台所在象限停留时间与穿越平台次数,与空白组比较,模型组均明显减少(P<0.05);
与模型组比较,其他各给药组象限停留时间增加(P<0.05);
阳性对照组、制远志组以及炆远志高剂量组穿越平台次数明显增加(P<0.05),但其余各组穿台次数虽有所增加,组间差异不具统计学意义(P>0.05),各组小鼠水迷宫游泳轨迹热图。见图1、图2。
图1 各组小鼠空间探索实验
图2 各组小鼠水迷宫轨迹热图
行为学实验结果表明,东莨菪碱致使小鼠的学习记忆能力明显下降,而远志及炮制品均能明显改善小鼠的学习记忆障碍,其中炆远志与制远志对模型小鼠学习记忆的改善效果要优于生远志。
3.2 脑组织中胆碱能系统指标与氧化应激指标测定
与空白组比较,模型组脑组织中ACH、ChAT水平明显下降(P<0.01),AChE水平显著增高(P<0.01)。与模型组比较,各给药组ACH均明显增高(P<0.05,P<0.01),AChE明显下降(P<0.05,P<0.01);
对于ChAT,生远志、制远志与炆远志高剂量组较模型组明显增高(P<0.05),而对照组、炆远志中、低剂量组虽有增高,但无显著差异。对于MDA、SOD,与空白组比较,模型组脑组织中MDA含量升高,SOD降低,差异均具明显统计学意义(P<0.01);
与模型组比较,各给药组MDA下降(P<0.05,P<0.01),阳性对照组、制远志和炆远志高剂量组SOD显著升高(P<0.01,P<0.05),而生远志、制远志与炆远志低、中、高剂量组各给药组之间小鼠脑组织中的ACH、ChAT、AChE、SOD以及MDA均无显著性差异,且各指标表达与剂量存在相关。见图3。
图3 小鼠脑组织中ACH、ChAT、AChE、MDA与SOD的表达
东莨菪碱为M受体拮抗剂,可阻断脑内乙酰胆碱受体结合位点,从而引起胆碱能系统功能障碍。研究表明,注射东莨菪碱会造成模型动物脑内胆碱能神经递质功能障碍、氧化应激反应增强,使认知功能下降、学习记忆减退[12]。该模型复制方法简便、重复性好、动物死亡率低,故东莨菪碱已被广泛接受为研究认知障碍的药理学模型,也是本研究复制模型的方式。
中枢胆碱能系统在认知功能方面发挥着重要作用,与学习、记忆密切相关,其中ACH是该系统中最重要的神经递质之一,随着机体器官老化而显著降低,胆碱能神经元丧失而诱发AD。ChAT是ACH合成限速酶,在胆碱与乙酰辅酶A合成ACH过程中起催化作用,AChE为ACH水解酶,在胆碱能突触内可破坏ACH,将其水解成胆碱和乙酸而失活,二者的活性共同影响着ACH水平。当AD发生时,脑组织中AChE水平上升,ChAT水平降低,ACH合成、储存与释放减少[13-14]。同时,由于人体内自由基氧化应激反应与认知功能障碍密切相关,当AD发生时,机体抗氧化能力下降或自由基清除减少,致使体内氧自由基、过氧化氢等活性氧(ROS)堆积,诱导神经细胞凋亡,进而造成学习记忆障碍。机体内发生氧化反应,细胞脂质过氧化,表现为脂质氧化产物MDA显著增加,SOD作为机体内源性抗氧化酶,可有效减轻脑部氧化应激所造成的损伤[15]。
本研究以东莨菪碱复制了小鼠学习记忆障碍,来评价远志炮制对益智药效作用的影响。结果表明,与空白组比较,模型组逃避潜伏期明显延长,原平台停留时间和穿台次数明显减少,脑组织ACH、ChAT、SOD水平明显降低,AChE与MDA水平明显上升。与模型组比较,各炮制品给药后能明显缩短逃避潜伏期,显著增加原平台停留时间炆远志高剂量与制远志组穿台次数明显增加。生远志组ACH、ChAT水平明显升高,AChE、MDA水平明显降低,制远志组与炆远志高剂量组ACH、ChAT、SOD水平均明显上升,AChE、MDA水平均明显下降,另外,炆远志高、中、低剂量组对各指标的改善结果,提示其药效作用与剂量存在依赖性。说明远志各炮制品均可明显改善模型小鼠学习记忆能力,其作用机制可能与调节中枢胆碱能系统功能与抗氧化应激反应有关。远志各炮制品之间药效差异较小,但炮制后对于学习记忆障碍的改善作用要优于生品。
此外,前期对远志炆制前后成分研究发现,炆制后远志成分含量、种类均发生了明显变化,与生品相比,炆远志提取物大部分含量均有所下降,但有效成分细叶远志皂苷、3,4,5-三甲氧基肉桂酸含量增加,同时引入了甘草苷、甘草酸等辅料甘草的成分;
且在大鼠血浆中发现入血原型成分种类与含量有所增加。故推测远志炆制后益智药效作用增强,可能与细叶远志皂苷等有效成分含量增加和辅料甘草成分引入有关。这为后续深入阐释炆远志炮制机理可提供数据支撑。