木尼热·阿布都克力木， 周丽楠， 郭远强， 木合塔尔·吐尔洪*
(1.喀什大学化学与环境科学学院，**喀什 844006)(2.南开大学药学院，天津 300350)
多糖是由10个以上单糖分子通过糖苷键聚合而成的一类生物大分子。作为蛋白质和核酸之外的第3类生物大分子，多糖广泛存在于动植物等生物有机体中，既是能量的来源和物质循环的中心，也是维持细胞形态和构架的重要骨架和支撑单元[1]。20世纪60年代起，人们进一步认识到，多糖直接参与细胞的分化、增殖等几乎所有生命活动，有广泛的生物活性[2]，如抗肿瘤[3]、抗病毒[4]等。因其具有广泛的活性、低毒、较好的生物相容性等特点，多糖在医药领域有广泛的应用前景[2,5]。
毛茛科(Ranunculaceae)翠雀属(DelphiniumL.)植物，均为草本植物，分布于北温带地区。我国约有114种，除台湾和广东海南以外在其他各省区均有分布，**地区约有30种[6]。该属部分植物是传统中药的来源，具有多种功效[7]。化学研究显示该属植物中含有丰富的生物碱，此外，还从该属植物中分离鉴定出一些三萜、黄酮、水溶性多糖类成分，这些成分大都具有显著的生理活性[8]。查阅文献发现，对该属植物化学成分研究，多集中于生物碱类成分的分离鉴定，有关水溶性多糖成分的研究鲜有报道。帕米尔翠雀花(DelphiniumlacosteiDanguy)，是高原植物，主要产于帕米尔高原、塔什库尔干，生长在海拔4300米以上的山坡。已有学者对翠雀属植物的化学成分进行研究报道，但有关帕米尔翠雀花的研究尚未见报道。鉴于翠雀属植物的药用价值，为探索帕米尔翠雀花的药用潜力，本文对帕米尔翠雀花含有的多糖类成分及活性进行研究。经高效液相色谱法(HPLC)对照品分析，其主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖5种单糖组成；
在体病毒活性测试显示DL90具有显著的抗烟草花叶病毒(TMV)活性。该研究可为**高原植物帕米尔翠雀花的开发利用奠定基础。
1.1 仪器、试剂与材料
UV-755B型紫外-可见分光光度计，上海佑科仪器有限公司；
Bruker Tensor 37型傅立叶变换红外光谱仪，Bruker公司；
1260分析型高效液相色谱仪，附UV3000紫外检测器(北京创新通恒科技有限公司)；
Sorvall LYNX 6000型高速落地离心机，上海安亭科学仪器厂；
FD-2型冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司。
1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮(PMP)，购于国药化学试剂有限公司；
单糖对照品甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)、岩藻糖(Fuc)购于成都德斯特公司；
三氟乙酸(TFA)购于阿拉丁试剂公司。正丁醇等化学试剂(分析纯)，购于天津渤化化学试剂有限公司。
帕米尔翠雀花(DelphiniumlacosteiDanguy)，2020年9月采自**喀什地区，塔什库尔干县，经喀什大学生命与地理科学学院艾沙江博士鉴定，标本(No.20200903)存放于喀什大学特色药食用植物化学自治区重点实验室。
1.2 帕米尔翠雀花多糖的提取及样品DL90的制备
采用热水提取与乙醇沉淀相结合的方法[9]。1 kg帕米尔翠雀花干燥药材，冷水浸泡过夜，药材与水的比例为1∶10(w/v)。浸泡结束后，80 ℃下提取3次，每次提取时间为3 h。合并提取液，浓缩，离心，得上清液。将无水乙醇加入上清液，直至溶液中乙醇的含量为90%，低温过夜后，5 000 r/min离心15 min，得沉淀即为醇沉提取物。
对沉淀中含有的蛋白质，采用Sevage法除去[10]。除蛋白试剂为正丁醇和二氯甲烷的混合溶液(1∶4)。将获得的沉淀溶解在水中，置入分液漏斗中，除蛋白试剂与沉淀溶解液按1∶4的比例混合，摇匀，静置，直至出现明显的分界线，下层变性蛋白弃去，留上层液体，重复3次。浓缩，除去正丁醇及二氯甲烷。用水透析48 h后，再次浓缩，冻干，即为帕米尔翠雀花多糖样品，记为DL90。
1.3 DL90的单糖组成分析
确定单糖组成，通常采用PMP柱前衍生化法[11]。各对照单糖的混合溶液的衍生化：各称取一定量9种对照标准品单糖，配制为2 mmol/L的溶液。取各标准溶液100 μL，依次加入500 μL 0.3 mol/L NaOH溶液，500 μL 0.5 mol/L PMP溶液，70 ℃反应30 min后，冷却至25 ℃，加入0.3 mol/L HCl调节pH=7，用等体积的氯仿萃取，取氯仿萃取后的水层，以0.45 μm滤膜过滤后，进行HPLC分析。
DL90的衍生化：准确称取5 mg帕米尔翠雀花多糖样品DL90，加入TFA，120 ℃水解 6 h，将水解后的水解液与甲醇共浓缩，除去TFA，然后向旋干的水解液样品中加入1 mL超纯水使其溶解，进行PMP衍生化，具体的操作步骤参考前面的方法，样品衍生化后，0.45 μm滤膜过滤，进行HPLC分析。
色谱条件：kromasil 100-5-C18色谱柱(250 mm×4.5 mm，5 μm)；
0.1 mol/mL磷酸盐缓冲液-乙腈(体积比83∶17)(pH=6.9)，流速0.8 mL/min；
设定检测波长250 nm；
进样20 μL分析。
1.4 DL90抗烟草花叶病毒(TMV)活性研究
1.4.1 对感染TMV的保护活性取心叶烟幼株(8～10片叶)，去除顶端，留底部小叶4～5片。将DL90水溶液涂于左半叶上，空白对照涂于右半叶。在光照充足的培养箱中培养24 h，将TMV接种于整片烟叶上，30 min后，用清水洗涤叶片。培养3～4天后，记录产生枯斑的数目[12]。
1.4.2 对感染TMV的治疗作用取心叶烟幼株(8～10片叶)，去除顶端，留底部小叶4～5片。采用摩擦法，将TMV接种在整片烟叶上，30 min后，用清水洗涤叶片。待叶片晾干后，用毛笔在左半叶轻轻涂上DL90水溶液，右半叶涂上对应空白溶剂。在光照充足的培养箱中培养3～4天，记录产生枯斑的数量[13]。
1.4.3 对TMV的钝化效果取心叶烟幼株(8～10片叶)，除顶端，留底部小叶4～5片。取一定体积的DL90样品水溶液与等体积的含TMV溶液混合，钝化30 min。采用摩擦法，将含有多糖DL90样品的TMV接种在左半叶上，取一定体积的空白溶剂与TMV汁液等体积混合，采用同样的方法将TMV接种到烟叶右半叶上，30 min后，用清水冲洗，在光照培养箱中培养3～4天后，记录产生枯斑的数目[14]。
2.1 DL90中蛋白与核酸分析
取0.1 mg/mL多糖样品DL90水溶液，在波长200～400 nm范围内测量样品的紫外光谱。如图1所示，根据其在260 nm(核酸的紫外吸收)、280 nm(蛋白的紫外吸收)处的吸收，判断帕米尔翠雀花多糖样品DL90含有蛋白与核酸[15]。
图1 DL90的紫外光谱Fig.1 UV spectrum of DL90
2.2 DL90的红外光谱分析
取2 mg干燥的帕米尔翠雀花多糖样品DL90与KBr混合，压片，测DL90的红外光谱(4 000～400 cm-1)[16]。如图2所示，在3360、2935、1627、1423、1053 cm-1有明显的吸收峰，符合多糖的红外吸收特征，DL90具有多糖的相应吸收峰，表明制备获得的样品DL90主要含有多糖。
图2 DL90的红外光谱Fig.2 FT-IR spectrum of DL90
图3 对照品和帕米尔翠雀花多糖样品DL90单糖组成色谱图Fig.3 Chromatograms of monosaccharide reference substances and monosaccharide composition of DL90 prepared from D.lacostei1：Man；
2：Rha；
3：GlcA；
4：GalA；
5：Glc；
6：Gal；
7：Xyl；
8：Ara；
9：Fuc.
2.3 DL90的糖含量及蛋白含量测定
采用苯酚-硫酸显色方法测定DL90中的糖含量[17]。准确称取葡萄糖50 mg，去离子水溶解，100 mL容量瓶定容，分别取40、100、160、200、400、600 μL于EP管中，加去离子水至1 mL，混匀，取400 μL置于试管中，加苯酚200 μL、浓硫酸1 mL，混匀后，测定每组的吸光度值(490 nm)，建立标准曲线。准确称取5 mg 帕米尔翠雀花多糖样品DL90，定容于100 mL容量瓶，加入苯酚及浓硫酸，490 nm波长下测样品的吸光度值，计算帕米尔翠雀花多糖DL90中糖(碳水化合物)含量。
DL90中的蛋白质含量，根据文献报道的考马斯亮蓝法测定[18]。称取牛血清白蛋白10 mg，溶解并定容于10 mL容量瓶中，分别取10、20、30、40、50、60、80和100 μL于干净试管中，分别加水至1 mL，混匀，向各试管中加入现配的考马斯亮蓝溶液5 mL，混匀后，测每组样品的吸光度值(595 nm)，建立标准曲线。准确称取50 mg DL90冻干粉末，溶解并定容于10 mL容量瓶，加入考马斯亮蓝溶液后，测定波长595 nm吸光度，计算帕米尔翠雀花多糖样品DL90中的蛋白含量。
测定结果显示，DL90中糖含量和蛋白质含量分别为59.5%和4.6%，多糖是DL90的主要成分，与DL90的紫外光谱分析结果一致。
2.4 DL90的单糖组成与比例
经柱前衍生化，HPLC分析，如图3所示，帕米尔翠雀花多糖样品DL90含有5种单糖：甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖，这5种单糖的比例为1.35∶1.26∶1.61∶2.89∶1.00，未检出酸性糖，表明制备获得的帕米尔翠雀花多糖样品DL90是中性杂多糖。
2.5 DL90抗TMV活性
DL90抗TMV活性，利用半叶枯斑法进行测定。利巴韦林及宁南霉素作为对照，测试结果如图4所示。当浓度为500 mg/mL时，帕米尔翠雀花多糖样品DL90对感染TMV的保护作用、治疗作用和钝化效果分别为38.2%、36.9%和40.4%，均比对照药剂宁南霉素低，但与对照药剂利巴韦林接近。当浓度降为100 mg/mL时，抗TMV活性也随之降低。活性测试显示，帕米尔翠雀花多糖样品DL90具有一定的抗烟草花叶病毒活性，DL90由5种单糖构成，其中半乳糖比例最高，推测其活性可能与其由多种单糖组成有关；
此外，多糖的特性，如生物相容性、与细胞表面受体结合等，阻止病毒的黏附和复制过程，发挥抗病毒活性，具体的抗病毒活性与机制有待于进一步研究。
图4 DL90的抗烟草花叶病毒活性A:对感染TMV的保护作用；
B:治疗作用；
C:钝化作用Fig.4 The anti-TMV activities of DL90A:Protective effects on TMV infection;B:Therapeutic effects;C:Passivation effects.
本文采用热水提取、乙醇沉淀等步骤，制备得到帕米尔翠雀花多糖样品DL90。DL90主要含有多糖，红外光谱呈现明显的多糖特征吸收峰，糖含量为59.5%。单糖组成分析表明，DL90由5种单糖组成，半乳糖含量最高。半叶枯斑实验测证实，DL90对感染TMV的保护效果、治疗效果和钝化效果与对照药剂利巴韦林接近。该研究为帕米尔翠雀花多糖的进一步开发和应用提供了参考。
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