邱靓琳，瞿利花，单士刚，李明轩**，周 蕊
(1.湖北科技学院医学部药学院，湖北 咸宁 437100；
2.武汉大学基础医学院；
3.湖北科技学院医学部基础医学院)
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)起源于肝实质细胞，其发生率约占肝脏原发恶性肿瘤的90%[1]。肝癌在肿瘤疾病中仅次于胃癌和肺癌的死亡率[2]，它具有患病不易察觉、发病后恶性程度高以及治疗和预后较差等特点[3]，严重损害人民的生命健康及生活质量。研究表明[4]，导致HCC发生的主要风险因素有感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)或丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)、过度饮酒、接触亚硝胺类致癌物以及黄曲霉素的暴露等。原癌基因的激活以及抑癌基因的失活是促进正常细胞转变为癌细胞的根本原因[5]。因此，找寻新的HCC相关基因，探讨该基因在HCC发生发展过程中的具体作用机制，有助于发现新的HCC生物标志物和药物治疗靶点，从而造福肿瘤患者。
炎症细胞因子/趋化因子的协同表达涉及决定基因转录、翻译和mRNA降解速率的多个步骤。虽然转录是炎症细胞因子/趋化因子表达调控的第一步，但包括mRNA降解在内的转录后调控是控制蛋白质合成的关键。RNA结合蛋白通过与细胞因子mRNA 3′端非编码区上富含AU元件(AU-rich element，ARE)的结构结合[6]，在转录后水平调控细胞因子的表达，从而调节细胞因子mRNA的稳定性。K-H型剪接调控蛋白(KH-type splicing regulatory protein，KSRP)是一种重要的RNA结合蛋白，有研究证实KSRP可以通过结合具有重要免疫功能的mRNA 3′UTR的ARE结构，来调控免疫功能因子[7]。研究表明[8-9]，在蛋氨酸/胆碱缺乏饮食的小鼠中，KSRP可抑制肝脏脂肪变性、炎症和纤维化。另外有报道称[10]，γ干扰素(IFN-γ)刺激肝细胞可以上调KSRP表达，提示KSRP可能在肝脏相关疾病中发挥重要的调控作用，但是，KSRP对HCC增殖凋亡影响的具体分子机制目前尚未报道。
本研究通过转染shRNA敲低KSRP在HepG2中的表达，并分析对其细胞周期、细胞增殖和细胞凋亡的影响，为进一步研究HCC发生发展机制提供新的依据。
1.1 主要材料与设备
人肝肿瘤细胞系HepG2来源于本实验室细胞库；
KSRP敲低质粒购于上海毅乐生物科技有限公司，过表达质粒由实验室自构建；
DMEM培养液、胎牛血清和胰酶均购于美国GIB-CO公司；
慢病毒包装辅助质粒Gag、Rev、Vsvg购于Addgene代理公司；
转染试剂NeofectTM购于NEOFECT公司；
CCK-8检测试剂盒购于MedChemExpress公司；
RIPA(强)细胞/组织蛋白裂解液和ECL化学发光剂均购于武汉赛维尔生物科技有限公司；
BCA法蛋白定量试剂盒购于Biosharp公司；
KSRP一抗购于Bethyl公司；
α-Tubulin购于Santa Cruz生物技术公司；
HRP标记的二抗购于北京博奥龙免疫技术有限公司；
FACSCanto流式细胞仪购自美国BD公司；
Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购于碧云天(Beyotime)公司；
Illumina TruSeq RNA文库制备试剂盒由康圣环球基因技术有限公司提供。
1.2 研究方法
1.2.1 KSRP与肝癌的临床关联分析
肝癌组织中KSRP表达的临床数据来源于Gene Expression Omnibus(GEO)数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE60502)，利用该数据库分析KSRP在肝癌组织和癌旁组织中的表达。
1.2.2 细胞培养及稳转细胞系的构建
在37℃，5%CO2的培养箱中，将HepG2细胞用含有10%胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)和1%青霉素、链霉素的DMEM培养基培养。细胞长至60%～80%汇合度时，使用慢病毒敲低或过表达KSRP，通过嘌呤霉素筛选敲低或过表达KSRP的稳定表达HepG2细胞系。
1.2.3 Western印迹实验
收集待检测细胞，用RIPA裂解液裂解细胞后提取总蛋白，使用10%的SDS-PAGE凝胶电泳，通过恒流350mA，转2h的条件转至PVDF膜上，再使用5%牛奶封闭1h，之后用一抗4℃孵育过夜，第二天用TBST洗膜后，二抗孵育1h，再次使用TBST洗涤3次，最后使用ECL发光液在暗室中用胶片曝光显影，结果使用Image J灰度分析后进行数据统计。
1.2.4 细胞增殖能力检测
将细胞在96孔板(3×103个/孔)中分别培养24、48、72、96h。弃去培养基，将100μL含有10%FBS的DMEM培养基和10μL的CCK-8测定缓冲液加至各孔中，37℃避光孵育1h后，在450nm处检测吸光度(OD)值，绘制细胞生长曲线。
1.2.5 RNA序列(RNA-seq)
使用稳定敲低KSRP的细胞，根据说明书使用Illumina TruSeq RNA制备试剂盒构建文库。检测KSRP shRNA处理后的细胞与对照细胞的差异表达。每组3次独立重复。计数用碎片每千碱基每百万(FPKM)值进行标准化。使用String Tie软件(v1.3.4d)计算转录本的表达水平。其他参数设置为默认值。RNA-seq FASTQ文件保存在NCBI的基因表达Omnibus(GEO)中，可通过GEO登录号访问。RNA测序由Kindstar(Kindstar,Wuhan,China)完成。
1.2.6 流式细胞仪检测细胞周期
收集对数生长期稳定敲低的KSRP和阴性对照HepG2细胞，按每孔5×105个接种在6孔板中。培养48h后收集细胞，加入体积分数为70%预冷乙醇500μL置于4℃固定过夜，染色前用PBS洗去固定液。加RNase A 100μL置37℃恒温水浴30min，再加PI染液400μL染色，置4℃冰箱，避光孵育30min。流式细胞仪检测，数据分析处理采用Moditfit软件，每个样品均分析10 000个细胞。
1.2.7 细胞凋亡检测
收集对数生长期稳定敲低的KSRP和阴性对照HepG2细胞，调整细胞浓度为5×105个/mL，接种于6孔板。细胞培养箱中培养24h后收集细胞，PBS洗涤、离心2次，加入100μL的1×Binding Buffer重悬细胞，加入5μL Annexin V-FITC和10μL PI Staining Solution，轻轻混匀，避光、室温反应10～15min，之后加入400μL的1×Binding Buffer，混匀后放置于冰上，样品在1h内用流式细胞仪检测。数据分析处理采用FlowJo 7.6软件。
1.3 统计学方法
2.1 KSRP在HCC患者中的表达
根据GEO中的临床信息，如图1所示，在18名病人的组织样本中，HCC组织中KSRP的表达量明显高于癌旁组织(P<0.001)。
图1 HCC组织及其对应癌旁组织KSRP的表达水平(***P<0.001)
2.2 过表达KSRP对肝癌细胞系增殖能力的影响
使用慢病毒过表达KSRP，通过嘌呤霉素筛选过表达KSRP的稳定表达HepG2细胞系，如图2A所示。随后，采用CCK-8法检测过表达KSRP后，HepG2细胞增殖能力的变化。结果如图2B所示，过表达KSRP后能显著促进HepG2的增殖能力(P<0.01)。
图2 过表达KSRP对肝癌细胞系增殖能力的影响(**P<0.01)
2.3 敲低KSRP对肝癌细胞系增殖能力的影响
为验证KSRP在肝癌细胞系中的促癌能力，使用慢病毒敲低KSRP，通过嘌呤霉素筛选敲低KSRP的稳定表达HepG2细胞系，如图3A所示。随后，通过CCK-8法检测发现，如图3B所示，敲低KSRP后能显著抑制HepG2的增殖能力(P<0.01)。
(**P<0.01)
2.4 敲低KSRP对RNA剪接的影响
使用Trizol法提取HCC细胞中的RNA，通过RNA-seq分析KSRP敲低后对基因转录的影响。如图4所示，与对照组相比，KSRP敲低后MKI67的外显子数量明显减少，表明KSRP敲低后抑制了MKI67基因的表达(P<0.05)。
图4 RNA-seq分析KSRP敲低后对抗原KI-67(MKI67)的影响
2.5 敲低KSRP对细胞周期的影响
采用对数生长期稳定敲低KSRP和阴性对照HepG2细胞分别进行培养，流式细胞仪检测细胞周期，结果如图5所示，相比于阴性对照组，敲低KSRP后G2/M期细胞从6.32%减少为0.18%，而S期细胞从28.37%增加到33.14%，表明敲低KSRP将HepG2细胞阻滞于S期(P<0.05)。
2.6 敲低KSRP对细胞凋亡率的影响
采用对数生长期稳定敲低KSRP和阴性对照HepG2细胞分别进行培养，Annexin V-FITC/PI双染法检测KSRP对HepG2凋亡的影响。如图6流式细胞散点图所示，HepG2细胞表现出4种不同类型的细胞群：活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞。shNC组细胞凋亡率为3.1%，低于shKSRP组的23.7%(P<0.05)，结果证明敲低KSRP能够促进HepG2细胞凋亡。
图6 Annexin V-FITC/PI双染法检测KSRP对HepG2凋亡的影响
HCC是一种常见的人类恶性肿瘤，具有高发病率和高死亡率的特点，也是主要的肝癌亚型[11]，其分子发病机制被认为是一个多步骤的过程，在这个过程中，细胞和分子的改变逐渐积累，如基因组突变、表观遗传调节以及转录组、细胞信号通路和代谢过程的改变等。有报道称HCC的发生、发展和转移是由促进细胞增殖、迁移和侵袭，抑制肝细胞凋亡和化疗耐药的多效性细胞信号通路所介导的[12-13]。KSRP是一种RNA结合蛋白，它能够识别并结合多种炎症细胞因子mRNA的3′UTR中的ARE结构，从而诱导转录本的降解或稳定性降低[7]。有报道称[14]，KSRP可以作为炎症反应以及癌症的关键调节因子，尤其是在肝脏促炎细胞因子和趋化因子的微调以及非小细胞肺癌等癌症细胞的增殖迁移方面发挥功能。在生理和病理条件下，KSRP的表达在细胞中都受到严格控制。虽然HCC有着较高的发病率和死亡率，但KSRP在该肿瘤中的作用和功能目前尚未报道。在本研究中，我们根据GEO数据库中的临床信息发现，与癌旁组织相比，HCC组织中KSRP的表达升高，通过CCK-8等实验发现，敲低KSRP能显著抑制肝癌细胞系HepG2的增殖和细胞周期进程，诱导HepG2细胞凋亡，这些结果提示KSRP可能是HCC中一种潜在的癌基因，参与该肿瘤的发生、发展过程。
细胞周期失调和肿瘤细胞的发生发展有着密切的联系。当细胞周期的调控机制受到破坏时，细胞周期会出现紊乱、失常，进而导致细胞不受控地无限增殖，特定DNA损伤会导致细胞无法凋亡，最终导致肿瘤生成[15]。因此，调控细胞周期的相关因子一定与肿瘤的发生发展密切相关，对调控细胞周期的相关物质进行深入研究，可以促进肿瘤防治的进展。本研究采用流式细胞术测定KSRP敲低前后的HepG2细胞周期和细胞凋亡情况，结果证明敲低KSRP后可以阻滞HepG2细胞周期，诱导HepG2细胞凋亡，提示敲低KSRP后能够抑制HCC的发展。
MKI67是一种增殖细胞相关的核抗原，其功能与有丝分裂密切相关，是评价细胞增殖状态的指标之一。目前临床研究证实[16]，MKI67阳性肿瘤细胞的分数(MKI67的标记指数)增高与多种恶性肿瘤的进展和预后相关。大量实验证实，MKI67在胃癌[17]、肝细胞癌[18]等多种肿瘤中的表达与治疗效果和预后都呈负相关。本研究通过RNA-seq发现敲低KSRP后引起HCC细胞中MKI67基因表达减少，提示敲低KSRP可以抑制HCC的细胞增殖。
综上所述，本研究初步证明了KSRP在HCC中发挥癌基因的作用，解析了其在HCC发生发展中的分子机制，这些发现有助于为HCC的预防和诊治提供新的思路，但仍需进一步深入研究。
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