粤糖93-159再生体系的建立

赵振丽, 黄潮华, 徐良年, 邓祖湖, 赵新旺,2, 黄国强

(1.福建农林大学国家甘蔗工程技术研究中心，福建 福州 350002；
2.广西大学广西甘蔗生物学重点实验室，广西 南宁 530004)

甘蔗(Saccharumspp.)为禾本科甘蔗属植物，原产于热带以及亚热带地区[1]。甘蔗不仅是糖料作物，还是重要的能源作物[2]。我国甘蔗种植区主要分布在云南、广东、广西、海南等地，其中广西地区的种植面积最大，约77.48万hm2[3-4]。组织培养是实现植物离体快繁的有效途径，也是植物脱毒和遗传转化的重要基础。甘蔗是第1个组织培养成功的禾本科植物[5]。组培过程中可能出现一些变异类型，可为育种提供一些特殊的基因型，如20世纪70年代就有研究者利用甘蔗组织培养获得抗斐济病亚无性系材料[6]；
利用甘蔗愈伤组织可获得转基因材料，如罗遵喜等[7]利用新台糖22号的愈伤组织获得了抗花叶病毒的转基因植株，胡天娇[8]利用农杆菌转化法把抗虫基因Cry2A转入到甘蔗的愈伤组织，获得了抗虫植株；
用诱变剂处理甘蔗愈伤组织可获得表现良好的突变材料，如陆耀邦等[9]用质量分数为0.1%的EMS处理桂糖1号、桂糖11号、台糖134的愈伤组织，获得了2个高产高糖突变株系。

粤糖93-159由中国轻工业总会甘蔗糖业研究所杂交选育，其母本是粤农73-204，父本是美国大陆蔗区主栽品种CP72-1210[10]。该品种属于特早熟、高产、高糖品种，具有萌芽率高、分蘖力强、生长快和长势均匀等特点[11]，2014—2019年累计种植约47.95 hm2[12]。粤糖93-159常用作杂交育种的亲本，以其为亲本选育出粤糖06-233、粤糖05-267、粤糖03-373等优良品种。但粤糖93-159抗旱性略差，对花叶病菌敏感[7,13]。若以粤糖93-159为基础基因型，结合组织培养、诱变等方法，通过人工定向选择和鉴定，有望创制出具有抗旱、抗病等优良特性的突变体材料。基于此，本研究对粤糖93-159进行了愈伤组织诱导、分化和生根的试验，以期建立其再生体系。

1.1 供试材料

2021年7月，选取福建农林大学甘蔗种质资源圃保育的粤糖93-159为供试材料。

1.2 试验方法

1.2.1 愈伤组织的诱导培养 晴朗的中午，取田间生长健壮的甘蔗茎梢部位，用体积分数为75%酒精消毒外表后置于超净工作台中进行无菌操作。将外叶鞘层层剥至出现直径大约为1 cm的白色幼嫩心叶部分，将其切成约1～2 mm厚的心叶片接种到愈伤诱导培养基中。以MS+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1琼脂为基本培养基，愈伤诱导培养基(A1～A4)分别添加1.0、2.0、3.0、4.0 mg·L-12,4-D。每个处理接种5瓶，每瓶接种6片，3次重复。25 ℃暗培养15 d后，观察、统计愈伤的诱导情况。

愈伤诱导率/%=(诱导出愈伤的心叶片数/接种心叶片数)×100

1.2.2 愈伤组织的分化培养 选择生长状况一致、大小均匀的愈伤组织，接种到分化培养基上。以MS+0.2 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1琼脂为基本培养基，分化培养基(B1～B5)分别添加0、1.0、2.0、3.0、4.0 mg·L-1细胞分裂素6-BA。每个处理接种6瓶，每瓶接种5块愈伤，3次重复。于光照培养箱中进行芽的分化诱导，设置培养温度为28 ℃，光照强度为54 μmol·m-2·s-1，光周期为12 h·d-1，20 d后统计分化率。

分化率/%=(分化出芽的愈伤组织块/接种愈伤组织块总数)×100

1.2.3 生根诱导培养 分化培养获得的组培苗继代增殖2～3代后，选择大小一致的组培苗(4～5片叶)接种到生根培养基。以1/2MS+30 g·L-1蔗糖液体培养基为基本培养基，生根培养基(C1～C6)分别添加2.0、3.0、4.0 mg·L-1NAA和0、0.5 mg·L-1活性炭(activated carbon, AC)。每个处理接种5瓶，每瓶接种10株，3次重复。培养20 d后，观察、统计根系的生长状况。

1.2.4 炼苗驯化与移栽 生根诱导培养约20 d后，将组培瓶苗移到自然光下继续炼苗1周，而后打开瓶盖再炼苗驯化3 d，使苗逐步适应外界的光、温、湿度条件。炼苗驯化后洗净根部残留的培养基，将苗在质量分数为0.05%多菌灵消毒液中浸泡10～15 min，之后将苗移栽到穴盘中。以营养土、黄土和细砂等比例混合为栽培基质。移栽后盖上盘盖保温保湿3～5 d，期间全程置于遮阳网下以免强光照射，待苗抽出新叶后再揭去盘盖让其自然生长。

1.3 统计与分析

采用Excel统计与整理数据，采用SPSS进行LSD和Duncan分析。使用根系扫描仪(Epson prepection 700 photo)扫描根系状态，利用根系分析软件Winrhizo分析根系图片。

2.1 2,4-D浓度对粤糖93-159愈伤诱导的影响

从表1可见，4种质量浓度2,4-D均能诱导出愈伤组织，但不同浓度诱导出的愈伤状态存在明显差异。其中，A4处理(4.0 mg·L-12,4-D)的诱导率最低且愈伤组织的状态最差，出现了严重的褐化；
A2处理(2.0 mg·L-12,4-D)诱导率达到95.37%，显著高于其他处理，愈伤淡黄色且体积较大、结构紧密，明显比其他处理新鲜、有活力(图1)。因此，诱导粤糖93-159愈伤组织的最佳2,4-D质量浓度为2.0 mg·L-1。

A.诱导15 d;B.继代15 d。

表1 不同浓度2,4-D对粤糖93-159愈伤诱导的影响1)

2.2 6-BA浓度对粤糖93-159愈伤分化的影响

把愈伤组织转到分化培养基上，1周左右即可分化出芽。从表2和图2可以看出，不含6-BA的B1处理愈伤组织褐化严重，分化率最低，芽弱小；
B2处理(1.0 mg·L-16-BA)分化率为42.22%，芽生长健壮；
B3处理(2.0 mg·L-16-BA)分化率为41.11%，芽生长健壮。当6-BA质量浓度提高到3.0 mg·L-1时，B4处理分化率反而下降，芽长势一般；
提高到4.0 mg·L-1时，B5处理分化率进一步下降且愈伤组织褐化严重。由上可见，高浓度的6-BA(≥3.0 mg·L-1)不利于愈伤的分化。B2、B3处理分化率相近，芽都生长健壮，但B2处理节省了试剂，因此分化培养基的6-BA最佳质量浓度为1.0 mg·L-1。

B1.未添加6-BA;B2～B5分别添加1.0、2.0、3.0、4.0 mg·L-1 6-BA。

表2 不同浓度6-BA对粤糖93-159愈伤组织分化的影响1)

2.3 活性炭和NAA对粤糖93-159组培苗生根的影响

根长、根表面积以及根平均直径是衡量根系生长好坏的重要指标。如表3所示，NAA能够促进粤糖93-159组培苗根系的生长，C3处理(4.0 mg·L-1NAA)相较于C1处理(2.0 mg·L-1NAA)根长更长，根表面积更大，但根系较细；
C2处理(3.0 mg·L-1NAA)和C3处理根系生长差异不明显。活性炭能够吸附有害物质，抑制褐化。从表3可见，生根培养基仅添加3.0 mg·L-1NAA、未添加活性炭，粤糖93-159组培苗根系粗壮、根数多，根较短且出现了愈伤(图3A)；
添加3.0 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1活性炭，粤糖93-159组培苗根系较长，但根数较少且较细(图3B)。因此，粤糖93-159最佳生根培养基为：3.0 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1活性炭。

表3 活性炭和NAA对粤糖93-159组培苗生根的影响1)

A.3.0 mg·L-1 NAA；
B.3.0 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1活性炭。

本研究以粤糖93-159嫩叶鞘作为外植体进行愈伤组织诱导，污染率低，诱导效果比较好。其他植物中，如烟草[14]、马铃薯[15]等常选用叶片作为外植体，白菜[16]、番茄[17]等常选用子叶和下胚轴作为外植体。这些外植体进行愈伤诱导时，消毒杀菌通常较繁琐，包括75%酒精浸泡、无菌水冲洗、氯化汞浸泡等步骤。本研究中，由于甘蔗嫩叶鞘位于生长点上，不需要多步骤消毒，减轻了工作量。

基因型差异是影响植物组培特性的最主要因素，不同基因型甘蔗离体培养效果不同。吕平等[18]研究发现，相同条件下新台糖22号、03-75、B8、02-64等4个甘蔗品种(系)愈伤组织的诱导率、分化率、增殖率和生根率不同，说明不同基因型在组织培养过程中表现出来的特性不同。陈敏敏等[19]对3种基因型甘蔗材料进行组织培养，发现不同基因型茎尖褐化率及成活率不同。梁丽君[20]利用Badila进行愈伤诱导时，诱导率为87.5%。本研究利用2,4-D处理粤糖93-159嫩叶鞘组织，得到的最佳诱导率为95.37%；
利用6-BA进行分化培养，得到最佳分化率为42.22%。因此，甘蔗基因型不同，离体培养效果有差异。

激素浓度的控制对再生体系的建立至关重要。2,4-D是促进外植体脱分化的有效激素[21]。本研究中，低浓度2,4-D诱导出来的粤糖93-159愈伤组织细胞团易破碎，较高浓度诱导出来的愈伤组织褐化严重且细胞团质地较软，这与韦海球等[22]对桂柳05136愈伤的诱导结果相一致。本研究中， 2,4-D最佳诱导浓度为2.0 mg·L-1，此浓度下诱导出来的愈伤组织质量较好。甘蔗愈伤组织的诱导还要注意取材时间、季节。刘怡等[23]研究表明，在诱导培养基中加入少量椰乳也能够较大提高愈伤组织的质量。朱万升等[24]研究表明，6-BA能够促进细胞分裂，在分化培养基中添加少量NAA分化效果则更明显。6-BA浓度过低或过高均不利于愈伤组织的分化，且愈伤组织褐化严重、分化出来的芽较弱小，生长缓慢[25-26]。本研究中，1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA为最佳分化激素组合。生根是建立再生体系的重要环节，强壮的根系能够提高组培苗移栽时的存活率[27]。本研究发现，3.0 mg·L-1NAA处理最有利于组培苗根系生长；
本研究还发现，含有3.0 mg·L-1NAA的生根培养基中添加0.5 mg·L-1活性炭，根系更长更多，这与徐新江等[28]对新台糖16号生根试验结果相一致。

综上所述，本研究利用不同浓度的激素处理有效建立了粤糖93-159的再生体系，为该品种组培快繁、遗传转化体系建立及利用愈伤组织进行诱变育种等提供了理论依据。

推荐访问:再生 体系 建立