吴 琼，周永欣，赵泽林，张丽艳，李 军，马四补
(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025)
蓝布正为蔷薇科水杨梅属植物路边青或柔毛路边青的干燥全草。因形态、功效方面相似相同，又称为头晕药，别名追风七、水杨梅等[1-2]。贵州地区分布多为柔毛路边青。
蓝布正为我国民间传统中药材，在我国众多少数民族中皆有广泛使用，其中贵州苗族用来治疗“眩晕病”效果明显。除此之外还可用于小儿惊风、高血压、腰腿疼痛等症状。现代药理学研究表明，其具有抗炎、抗肿瘤、抗凝血、抗高血压等药理作用[3]。目前市场上蓝布正已有相应的民族药或中药等制剂如追风七汤[4]、蓝芷安脑胶囊[5]、云实感冒合剂[6]、感清糖浆[7]等。
1.1 仪器与试剂
RE2000A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)、UV2501PC紫外分光光度计(日本岛津)、Tharmo ST16R台式高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技有限公司)、XS205电子分析天平(瑞士梅特公司)、无水乙醇、浓硫酸、苯酚、葡萄糖(分析纯，重庆川东化工有限公司)。
1.2 药材来源
实验药材蓝布正产自贵州省安顺市，经贵州中医药大学王波教授鉴定为蔷薇科水杨梅属植物的干燥全草。
2.1 溶液制备
供试品溶液：称取蓝布正样品5 g，加入适量的水浸泡，加热回流提取两次，过滤，合并两次滤液，减压浓缩至50 mL，取1 mL浓缩液加入4 mL无水乙醇沉淀，静置12 h，4000 r/min离心5 min，加水至10 mL使沉淀完全溶解，即得。
对照品溶液：称取无水葡萄糖50.30 mg，精密称定，置于50 mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度定容，摇匀，再吸取5 mL稀释定容至50 mL，制得0.1006 mg/mL的葡萄糖对照品溶液，备用。
5%苯酚溶液：称取苯酚5.0021 g，加少量水定容至100 mL棕色容量瓶中，摇匀，冷藏储存。
2.2 检测波长的确定
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液0.8 mL，加水至2 mL，滴加1 mL 5%苯酚、5 mL浓硫酸，于沸水浴20 min，冷却至室温。以相应试剂作为空白，在波长350～700 nm范围内进行扫描，确定483 nm为最大吸收波长。
2.3 方法学考察
2.3.1 标准曲线制备
根据“2.1”项下制备标准曲线溶液，精密吸取对照品溶液0.2 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL，加蒸馏水分别定容至2 mL，于483 nm吸收波长下进行测定。以吸光度为纵坐标(Y)，浓度为横坐标(X)绘制标准曲线，见图1。得回归方程y=53.9164x+0.0038(R2=0.9993)。由此得到葡萄糖溶液浓度在0.00252～0.01509 mg/mL范围内有良好的线性关系。
图1 标准曲线图Fig.1 Standard curve
2.3.2 精密度试验
精密吸取“2.1”项下1.0 mL葡萄糖对照品溶液，以相应试剂为空白，连续6次测定吸光度。结果表明，RSD为0.32%(n=6)，表明仪器精密度良好。
2.3.3 稳定性试验
称取蓝布正样品适量，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，分别于30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min时测定吸光度，计算吸光度RSD。结果表明，吸光度RSD为0.26%(n=6)，表明样品溶液稳定性良好。
2.3.4 重复性试验
称取蓝布正样品适量(n=6)，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，分别测定吸光度，结果表明，多糖含量RSD为0.47%(n=6)，表明该方法重复性良好。
2.3.5 加样回收试验
取已知含量样品6份，精密称定，加入适量的对照品溶液，分别按“2.1”项下方法制备供试品溶液，测定吸光度，计算加样回收率，结果表明，多糖平均加样回收率为100.60%，RSD为1.02%(n=6)。
2.4 单因素考察
2.4.1 浸泡时间
精密称取蓝布正样品5 g，各5份，加入10倍量的水，分别浸泡20 min、40 min、60 min、80 min、100 min，加热回流提取60 min，按“2.1”项下制备供试品溶液，计算多糖含量。试验证明，浸泡60 min时多糖含量最高为10.22 mg/g，如图2。
图2 浸泡时间对黔产蓝布正水溶性总多糖含量的影响Fig.2 Influence of soaking time on the content of water-soluble polysaccharide in Herba Gei
2.4.2 料液比
精密称取蓝布正样5 g，各5份，分别加入10倍，15倍，20倍，25倍，30倍量的水，浸泡60 min，加热回流提取60 min，按“2.1”项下制备供试品溶液，计算多糖含量。试验证明，料液比为15倍量水时多糖含量最高为11.11 mg/g，如图3。
图3 料液比对黔产蓝布正水溶性总多糖含量的影响Fig.3 Influence of solid-liquid ratio on the content of water-soluble polysaccharide in Herba Gei
2.4.3 提取时间
精密称取蓝布正样品5 g，各5份，加入15倍量水，浸泡60 min，分别加热回流提取30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，按“2.1”项下制备供试品溶液，计算多糖含量。试验证明，提取60 min时多糖含量最高为12.70 mg/g，如图4。
图4 提取时间对黔产蓝布正水溶性总多糖含量的影响Fig.4 Influence of extraction time on the content of water-soluble polysaccharide in Herba Gei
2.5 Box-Behnken法优化蓝布正多糖提取工艺研究
2.5.1 响应面优化试验
根据单因素试验的结果，以A、B、C3个影响因素为自变量，蓝布正多糖含量为响应值Y，采用响应面法优化试验设计，通过17个实验确定最优提取工艺条件，Box-Behnken试验因素与水平见表1。
表1 Box-Behnken试验因素与水平Tab.1 Box-Behnken test factors and levels
2.5.2 响应面方案与试验结果
利用响应面软件Design-Expert8.0.6设计三因素三水平试验，设计方案及结果见表2，测定总多糖含量，得到回归模型方差分析见表3。
表2 Box-Behnken试验结果与分析Tab.2 Box-Behnken test results and analysis
对表2数据进行拟合，Y对各因素的回归方程为：
Y=+13.11+0.26A+0.20B+0.024C-0.46AB-0.44AC-0.10BC-1.36A2-2.75B2-2.99C2。
表3 响应面二次模型总多糖含量的方差和回归系数分析Tab.3 Analysis of variance and regression coefficient of total polysaccharide content in response surface quadratic model
显著性结果显示：A2、B2、C2项(P<0.01)对总多糖含量均有极显著影响；
AB项(P<0.05)对总多糖含量影响显著；
A、B、C项(P值分别为0.0857、0.1646、0.8616)对总多糖含量影响不显著。
2.5.3 响应面交互分析
响应面曲面的陡峭程度反映两因素间的交互作用；
等高线的形状可以反映出交互效应的强弱大小，椭圆形表示两因素的交互作用显著，圆形则相反[8-9]。文献研究表明[10-12]，在响应面图中，如果曲面呈现越陡峭的趋势，则该因素对其的影响越大。
由图5可知，浸泡时间(A)-料液比(B)、浸泡时间(A)-提取时间(C)、料液比(B)-提取时间(C)交互作用对黔产蓝布正水溶性总多糖含量影响的响应面均为一个向下的曲面。其中，交互项AB的响应面坡度较为陡峭，等高线图呈椭圆形，说明浸泡时间(A)与料液比(B)交互作用最强，影响显著；
而交互项AC、BC等高线图呈现的椭圆形程度较小，特别是BC的交互作用等高线图近乎呈圆形，说明浸泡时间(A)-提取时间(C)、液比(B)-提取时间(C)交互作用不显著。
图5 各因素交互作用对总多糖含量的响应面和等高线图Fig.5 Response surface and contour diagrams of interaction of various factors influencing the total polysaccharide content
2.6 响应面优化与验证试验
经响应面优化得到最优条件：浸泡时间61.86 min、料液比1∶15.14(g/mL)、提取时间59.91 min，多糖含量为13.1178 mg/g。依据实际操作条件浸泡时间60 min、料液比15倍(g/mL)、提取时间60 min，多糖含量为13.10867(mg/g)。响应面优化后的条件与实际操作条件相差较小，实验所得实际值与预测值之间相差较小，验证了该响应面模型的有效性。因此，响应面法对黔产蓝布正水溶性总多糖的最佳优化工艺为浸泡时间60 min、料液比15倍(g/mL)、提取时间60 min。
分别称取三批蓝布正药材5 g，根据优化条件提取，按照“2.2”项下方法测定吸光度，总多糖平均含量分别为13.10 mg/g、13.08 mg/g、13.09 mg/g。
2.7 15批蓝布正药材多糖含量测定结果
根据“2.3.1”项下制备标准曲线溶液。以吸光度为纵坐标(Y)，对照品溶液的浓度为横坐标(X)绘制标准曲线(图6)：得回归方程y=56.292x-0.0087(R2=0.9996)。在0.00252～0.01509 mg/mL范围内与吸光度有良好的线性关系。15批蓝布正多糖含量范围为6.08～13.05 mg/g，遵义1(8.18 mg/g)、遵义2(8.79 mg/g)、遵义3(9.54 mg/g)、贵阳1(7.28 mg/g)、贵阳2(6.08 mg/g)、贵阳3(6.53 mg/g)、毕节1(7.72 mg/g)、毕节2(8.47 mg/g)、毕节3(8.43 mg/g)、安顺1(13.05 mg/g)、安顺2(12.90 mg/g)、安顺3(12.83 mg/g)、织金1(12.28 mg/g)、织金2(11.62 mg/g)、织金3(11.21 mg/g)。
图6 标准曲线图Fig.6 Standard curve
本实验以黔产蓝布正药材为原料，以水为溶剂提取黔产蓝布正水溶性总多糖类成分，以浸泡时间、料液比和提取时间为考察因素，采用响应面法对黔产蓝布正水溶性总多糖的提取工艺进行设计优化，得出最佳提取工艺为：浸泡时间60 min、料液比1∶15(g/mL)、提取时间60 min，总提取量达到13.12(mg/g)，该模型具有良好的显著性。
测定多糖含量的有效方法是苯酚-硫酸法和紫外-可见分光光度法两者结合，即多糖与浓硫酸反应生成糠醛衍生物，再与苯酚生成有色物质，测定其吸光度[13-14]。该实验采用响应面法虽试验次数多，但从整体考虑三维图分析更直观，更加精确，克服了其他如正交试验预测性差、精度较低等缺点[15]。
实验中以黔产蓝布正总多糖含量测定实测值的平均值作为参考值，再通过工艺验证黔产蓝布正的总多糖含量，验证响应面模型的有效性。
综上所述，黔产蓝布正水溶性多糖可通过水提方法优化提取，该优化方法提取含量高、工艺稳定、重现性好。
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