李庆妍 刘 东
非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占所有肺癌的80%左右，发现时多为中晚期，严重危害人们的生命健康。表皮生长因子受体（EGFR）作为Her/ErbB受体家族的一员，是一种位于细胞表面的酪氨酸激酶（TK）受体，在与配体结合后发生二聚化，从而促进下游信号通路的激活，参与调控细胞的增殖和分化。吉非替尼作为首个表皮生长因子酪氨酸激酶受体抑制剂（EGFR-TKIs）靶向药物，可用于治疗转移性非小细胞肺癌EGFR 19 del或外显子21 L858R突变患者。尽管EGFR阳性突变的NSCLC患者经吉非替尼治疗后无进展生存期显著延长，但大部分的患者在治疗后几个月就出现耐药[1]。现有研究结果表明EGFR基因突变（如Kras突变）、二次基因突变（如T790M突变约占50%）以及旁路的激活等可能是EGFR-Tki原发/继发性耐药的重要机制，但具体机制仍不明确。因此探究吉非替尼耐药机制，对于疗效预测及克服肿瘤耐药具有重要的意义。近年来，不涉及基因序列改变的表观遗传学机制在肿瘤耐药中的作用日益受到关注，且成为目前肿瘤研究的热点。表观遗传修饰包括非编码RNA（non-coding RNAs）调控、DNA甲基化和组蛋白修饰等，可以在不改变DNA序列的情况下调控基因表达、维持基因组稳定性[2]。国内外学者对此进行了一系列研究，发现表观遗传学异常在EGFR-TKI耐药中发挥重要作用。因此，本文综述了NSCLC靶向治疗获得性耐药中的表观遗传学机制，以期为EGFR-TKIs耐药开发新的对策提供帮助。
非编码RNA包括LncRNAs、miRNAs等，但对于基因调控具有多种生物学功能，并与NSCLC耐药密切相关。
miRNAs是一种长度为18～25个核苷酸的小的非编码调控RNA，在癌症起始和进展过程中对几乎所有失调特征都有调节作用，包括细胞生长、增殖、转移、血管生成和凋亡。许多miRNAs通过靶向EGFR信号通路在癌症治疗过程中具有特定的调控作用；
miR21是研究最多的关于EGFRTKIs的miRNA，在肺癌细胞的生长和侵袭过程中表达上调。miR21表达抑制了EGFR突变体NSCLC细胞中PTEN（抑癌基因）和程序性死亡4基因（PDCD4）的表达，使得肿瘤细胞对EGFRTKI药物敏感性下降，出现耐药。它还对PI3K/AKT通路的激活有调节作用，其通过抑制PI3K/AKT通路来逆转吉非替尼的耐药性[3]和miR214的过表达。间质-上皮细胞转化因子（MET）扩增是吉非替尼获得性耐药最常见的替代途径，而miR130a的表达与MET呈负相关。miR130a通过与MET的3"-UTR结合抑制其表达，故miR130a过表达可以逆转吉非替尼的耐药性[3]。而miR181a的过表达，则会导致其靶基因GAS7（生长停滞特异蛋白7）表达下调，从而拮抗吉非替尼在耐药细胞的敏感性[4]。除此之外，miR153的表达下调和miR214的过表达均可导致肿瘤细胞对EGFRTKIs的耐药[1]。
LncRNAs是一种长度大于200个核苷酸的线性RNA，在基因调控中发挥作用。Wang Z等[5]对63例晚期肺腺癌患者的组织标本测定，用吉非替尼处理后发现获得性耐药组中LncRNA SNHG5显著下调，在原发性吉非替尼耐药组患者中没有差异。另有研究[6]则发现LINC00460与EGFR表达呈正相关，miR-769-5p与EGFR表达呈负相关。由此推测Lnc00460的过表达和LncRNA SNHG5的表达沉默均可导致肿瘤细胞对吉非替尼产生耐药。王守忠等[7]用不同浓度的吉非替尼处理肺癌细胞，用实时荧光定量聚合酶链反应检测吉非替尼耐药细胞中LncRNA GIHCG 与miR-204-5p的表达，用双荧光素酶报告基因验证LncRNA GIHCG 与miR-204-5p的靶向关系，证明了LncRNA GIHCG通过靶向调控miR-204-5p的信号通路，使得肺癌细胞对吉非替尼产生耐药。而陈晨等[8]发现GAS5（生长停滞特异蛋白5）的过表达与EGFR通路呈负相关，并能够逆转A549细胞对吉非替尼的耐药。
因此，研究非编码RNA可能为未来逆转吉替尼耐药提供一个治疗靶点。
染色质是由DNA、组蛋白和非组蛋白组成的复合物，组蛋白是一种小的、带正电荷的蛋白质。H2A、H2B、H3、H4四对核心组蛋白与带负电荷的DNA结合，共同形成的八聚体称为核小体。组蛋白伸出核小体外的氨基末端通过多种翻译后修饰来改变核小体的松紧结构，从而调控基因表达[9]。组蛋白修饰包括乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化、丁基化等。这些修饰方式依赖组蛋白修饰酶作用，这些酶能够“写入”“读取”或“擦除”表观遗传标记，成为潜在的治疗靶点。
各种研究表明，靶向外蛋白质组蛋白修饰可以改善肿瘤的耐药性。现有研究表明HDACs在癌症中经常过表达，并已成为潜在的治疗靶点。BCL-2相互作用的细胞死亡介质（BIM）是促凋亡蛋白BCL-2家族成员之一，BIM缺失会使TKIs无法诱导细胞凋亡，从而导致细胞对EGFR-TKIs耐药。伏立司他（一种HDAC抑制剂）已被证明可以恢复BIM的功能，导致细胞周期停滞、不可逆生长抑制及凋亡，进而恢复EGFR突变和吉非替尼耐药的NSCLC对吉非替尼的敏感性[10]。还有研究[11]发现p300或CREB结合蛋白（CBP）通过组蛋白乙酰化促进肿瘤的发生发展，而p300/CBP抑制剂A485与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体联合治疗对EGFR-TKIs耐药的NSCLC，发现凋亡的细胞数量增加，并对细胞增殖有长期抑制作用。而TCN19（一种新型的EGFR和肝细胞生长因子受体双重抑制剂）则是通过泛素蛋白酶降解组蛋白，从而诱导耐药的EGFR突变NSCLC细胞凋亡，克服了吉非替尼耐药性[12]。
近年来，DNA甲基化是肿瘤表观遗传学中的研究热点。DNA甲基化主要发生在CpG二核苷酸中，其中一个甲基被添加到胞嘧啶的第5位碳原子上。在正常生理条件下，它是一种动态平衡，由DNA甲基转移酶（DNMTs）和DNA去甲基化酶调控，对基因表达的调控和异染色质结构的稳定具有重要影响。研究表明，肿瘤抑癌基因CpG岛启动子中的基因特异性高甲基化和全基因组低甲基化可能与癌症的发生、发展有关。
DNA甲基化稳态的破坏与NSCLC靶向治疗获得性耐药具有相关性。原发性或获得性耐药的肿瘤细胞大多伴随DNA异常甲基化，且可能是肿瘤细胞耐药表型产生的重要机制。已有研究表明EGFR基因CpG岛的甲基化参与非小细胞肺癌的发生、发展过程。随后国内外研究者也对于靶向药物（包括EGFR TKI）耐药机制进行了系列探索研究，发现基因异常的甲基化可能导致靶向药物治疗敏感性降低。国内学者冯继锋研究团队发现EGFR基因启动子区甲基化可能是非小细胞肺癌细胞株H1650对吉非替尼获得性耐药的机制之一[13]。王起龙等[14]利用重亚硫酸盐测序法（bsp）对人肺腺癌pc9/gr耐药细胞株的EGFR基因甲基化进行研究，发现吉非替尼可能通过EGFR启动子甲基化诱导肺腺癌细胞产生获得性耐药。天津医科大学肿瘤研究所在细胞及动物体内进行了系列研究，发现低表达EGFR且EGFR基因CpG岛高甲基化的细胞系对吉非替尼不敏感，而后的去甲基化治疗可明显改善吉非替尼治疗的敏感性[15]。在细胞水平和动物模型上得到验证后，开始了一系列真实世界的探索研究。Nguyen HN等[16]在对EGFR-TKIs产生耐药的122例患者检测结果显示有多个基因调控区域出现高甲基化状态，其中一组参与调节癌细胞生长和分化的基因是Homeobox（HOX）基因。Shu SF等[17]通过对79例服用EGFR-TKIs的晚期肺腺癌患者的全基因组DNA甲基化分析和163例EGFR突变患者的焦磷酸测序，构建了一个DNA甲基化图谱，其中包含216个甲基化CpG位点，通过分析发现HOXB9的高甲基化可能与EGFR-TKIs的耐药有关。相关研究[10]通过对正常组织、肿瘤细胞系和原发肿瘤细胞的对比发现EGFR的CpG岛甲基化使得mRNA表达缺失，从而导致EGFR表达沉默，使得EGFR突变的实体肿瘤细胞系对吉非替尼耐药。而DNA甲基转移酶抑制剂（DNMTIs）地西他滨联合吉非替尼治疗则可以改善肿瘤细胞对吉非替尼的耐药性，恢复靶向药物治疗的敏感性。Song H等[18]用5-AzaCdR（一种DNMTIs）处理PC9/GR（存在T790M突变的吉非替尼耐药细胞系）后，死亡相关蛋白激酶（DAPK）启动子甲基化状态由高变低，而肿瘤细胞对吉非替尼的敏感性则由低变高。该实验证明了PC9/GR细胞系的DAPK基因启动子处于甲基化状态，可降低DAPK基因的表达甚至缺失，下调DAPK蛋白的表达，从而导致吉非替尼耐药。
由此可见，多种基因的甲基化可能参与了吉非替尼耐药，大多研究仅限于细胞水平及动物模型，对于其真实世界研究较少，并且由于检测方法的限制，仅能判定DNA甲基化定性，对于EGFR等基因具体甲基化水平（定量）、耐药相关的差异性甲基化CpG位点（定位）的检测筛选存在困难，因此探究非小细胞肺癌患者吉非替尼耐药后基因具体甲基化状态及寻找耐药相关差异性甲基化CpG位点至关重要。
EGFR-TKIs的耐药机制十分复杂，不同的机制之间也可以相互影响。在主要的表观遗传调控机制中，DNA甲基化可能是研究最多的，值得注意的是，肿瘤的表观遗传变化通过调节基因表达模式参与了获得性耐药性的进化，但仍缺少相关的表观基因组定量数据。本课题组结合前人研究基础深入研究并探讨DNA甲基化相关的耐药机制，筛选靶向治疗疗效预测及耐药相关甲基化CpG位点，可能作为EGFR-TKI疗效预测的分子标志物，同时为后续研发去甲基化药物的治疗提供精准靶点，更好地指导临床精准靶向用药。由于 DNA启动子甲基化是一个可逆的过程，表观遗传干预如去甲基化药物的研发和临床应用可能是逆转EGFR-TKI耐药的有效治疗策略。
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