戴炜辰，涂清波
（南京中医药大学翰林学院，江苏 泰州 225300）
银杏叶是银杏科植物银杏（Ginkgo bilobaL.）的干燥叶，性平，味甘、苦、涩，归心肺经，具有敛肺平喘、活血化瘀、通络止痛之功效。银杏叶的主要成分为黄酮类和萜内酯类[1]，而银杏叶黄酮类化合物根据化学结构可分为单黄酮、双黄酮和儿茶素等。其中，双黄酮含量较高[2]。现代药理研究表明，银杏叶双黄酮具有多种生物活性，包括抗炎、抗氧化、抗微生物、抗癌、神经保护和心血管保护等作用[3]。目前，关于银杏叶黄酮提取分离与纯化工艺的研究较多[4]，但是对银杏叶双黄酮提取和纯化工艺的研究很少。因此，本研究探索了表面活性剂联用超声酶解法提取银杏叶总黄酮的工艺，在此基础上研究了双黄酮的提取和纯化工艺，为银杏叶双黄酮的应用奠定基础。
1.1 仪器
电子天平（TD10002型，天津天马衡基仪器有限公司）；
超声清洗机（KQ-500B，昆山市超声仪器有限公司）；
紫外-可见分光光度计（UV-1100型，上海美谱达仪器有限公司）；
恒温水浴锅（HH-S1，金坛市医疗仪器厂）；
循环水式多用真空泵[SHZ-D（Ⅲ），上海锦赋实验仪器设备有限公司]；
高速离心机（H1850，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；
Agilent 1220 Infinity LC（安捷伦科技有限公司）。
1.2 试剂
芦丁标准品、银杏叶双黄酮标准品（成都普瑞法科技开发有限公司）；
纤维素酶（上海蓝季生物）；
醋酸盐缓冲溶液（pH=3.5）；
吐温20、吐温80、司盘80（化学纯，国药集团化学试剂有限公司）；
甲醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠等均为分析纯。
2.1 标准曲线的绘制和总黄酮得率的计算
以芦丁为标样，测定银杏叶总黄酮含量。配制质量浓度为0.2 mg/mL的芦丁标准溶液，精确吸取标准溶液0、2、4、6、8、10、12、14、16 mL置于50 mL容量瓶中。分别加入5%亚硝酸钠溶液2 mL，混匀，静置6 min后，加入10%硝酸铝溶液2 mL，摇匀，静置6 min。分别再加入4%氢氧化钠溶液20 mL，以水定容至刻度，摇匀，放置15 min后，以未吸取芦丁标准品的溶液为空白，在510 nm波长处测定其吸光度[5]。以芦丁质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线并求回归方程：
式中：ρ为根据标准曲线计算得到的样品黄酮质量浓度，mg/mL；
V为样品溶液的体积，mL；
N为样品的稀释倍数；
m为银杏叶粉末质量，mg。
2.2 提取方法
银杏叶中黄酮的提取一般采用超声法[5]或酶解法[6]。研究发现，在超声辅助酶解法的基础上加入表面活性剂，3项技术联用可以极大地提高总黄酮得率。将新鲜银杏叶低温烘干，用粉碎机粉碎后过60目筛，分别采用以下方法提取，结果如图1所示。
（1）超声提取：称取2.0 g银杏叶粉末，加入120 mL 70%乙醇溶液，40 ℃超声提取40 min。过滤后，取一定量的滤液，定容，紫外测定吸光度并计算得率。
（2）酶解提取：称取2.0 g银杏叶粉末，置于50 mL容量瓶中，加入20 mL HAc-NaAc缓冲溶液及15 mg纤维素酶，45 ℃酶解2 h，灭酶，用70%乙醇定容，提取后过滤。取一定量滤液，定容，紫外测定吸光度并计算得率。
（3）表面活性剂提取：称取2.0 g银杏叶粉末，加入20 mL蒸馏水，50 ℃浸提10 min后，加入0.4 g吐温80继续浸提20 min。过滤，取一定量提取液，定容，紫外测定吸光度并计算得率。
（4）表面活性剂联用超声酶解法提取：称取2.0 g银杏叶粉末，加入10 mg纤维素酶、20 mL蒸馏水，50 ℃超声提取，10 min后加入0.4 g表面活性剂（分别为吐温20、吐温80和司盘80），继续超声20 min。过滤，取一定量提取液，定容，紫外测定吸光度并计算得率。
由图1可知，相对于超声提取和酶解提取，采用表面活性剂的银杏叶总黄酮得率明显提高，而表面活性剂联用超声酶解法提取效果更好。分别选取3种常用的表面活性剂（吐温20、吐温80、司盘80），联用超声酶解法提取后发现，吐温20作为表面活性剂的提取效果最佳。因此，选取吐温20联用超声酶解法作为银杏叶黄酮的提取方法。
图1 不同提取法对银杏叶总黄酮得率的影响
2.3 银杏叶总黄酮的提取工艺
银杏叶黄酮提取采用表面活性剂联用超声酶解法，分别考察表面活性剂用量、纤维素酶用量、料液比和提取时间对总黄酮得率的影响，确定提取工艺条件。
2.3.1 表面活性剂用量的确定
称取2.0 g银杏叶粉末5份，各加入10 mg纤维素酶、20 mL蒸馏水，50 ℃超声提取10 min后分别加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g吐温20，继续超声20 min，过滤，取一定量提取液，定容，紫外测定吸光度并计算得率，结果如图2所示。由图2可知，当吐温20的用量达到0.6 g，即质量浓度为0.03 g/mL时，总黄酮得率最高；
当吐温20的质量浓度继续增大时，得率下降。
图2 表面活性剂用量对总黄酮得率的影响
2.3.2 纤维素酶用量的确定
称取2.0 g银杏叶粉末5份，分别加入2、6、10、14、18 mg纤维素酶，加入20 mL蒸馏水，50 ℃超声提取10 min后加入0.6 g吐温20，继续超声20 min，过滤，取一定量提取液，定容，紫外测定吸光度并计算得率，结果如图3所示。由图3可知，当纤维素酶的质量浓度为0.5 mg/mL时，总黄酮得率最高；
当纤维素酶的质量浓度继续增大时，得率明显下降。
图3 纤维素酶用量对总黄酮得率的影响
2.3.3 料液比的确定
称取2.0 g银杏叶粉末6份，各加入10 mg纤维素酶，分别加入20、40、60、80、100、120 mL蒸馏水，50 ℃超声提取10 min后加入0.6 g吐温20，继续超声20 min，过滤，取一定量提取液，定容，紫外测定吸光度并计算得率，结果如图4所示。由图4可知，当料液比在1∶40～1∶50时，总黄酮得率较高。
图4 料液比对总黄酮得率的影响
2.3.4 提取时间的确定
称取2.0 g银杏叶粉末6份，各加入10 mg纤维素酶、100 mL蒸馏水，50 ℃超声提取10 min后加入0.6 g吐温20，分别超声至总提取时间为30、40、50、60、70、80 min，过滤，取一定量提取液，定容，紫外测定吸光度并计算得率，结果如图5所示。由图5可知，当提取时间为60～70 min时，总黄酮得率较高；
当提取时间继续延长时，得率明显下降。
图5 提取时间对总黄酮得率的影响
2.4 银杏叶总黄酮的提取条件
根据以上实验可以得到优化的提取条件：表面活性剂选用吐温20，用量为0.03 g/mL；
纤维素酶用量为0.5 mg/mL；
料液比为1∶50；
提取时间为70 min。最后确定的工艺总黄酮得率达到1.207%。采用表面活性剂联用超声酶解法提取，不仅提高了银杏叶总黄酮得率，也为双黄酮的进一步纯化奠定了基础。
银杏叶双黄酮的纯化一般采用传统的硅胶柱层析色谱法[7]，然而，大量杂质或其他成分的干扰会使银杏叶提取物经柱层析后损失较多的双黄酮。考虑到黄酮可以与硫酸锌等络合[8]，与部分杂质分离，本研究尝试采用金属络合法预处理银杏叶提取液，发挥部分纯化的作用，再进行柱层析分离。通过比较双黄酮的提取率与纯度，对上述纯化方法进行评价。
3.1 银杏叶双黄酮纯化方法
3.1.1 直接硅胶柱层析法
取50 mL银杏叶提取液，用50 mL二氯甲烷萃取3次，合并萃取液，减压干燥后以少量乙酸乙酯溶解，湿法上样，以石油醚-乙酸乙酯（100∶1→1∶1）梯度洗脱，洗脱量为5～8倍柱体积。将收集的洗脱液减压浓缩，得银杏叶双黄酮样品。
3.1.2 金属络合联合硅胶柱层析法
取100 mL银杏叶提取液，加入0.5 g硫酸锌，充分搅拌至反应完全后，边搅拌边滴加NaOH溶液，调节pH至9。离心，收集沉淀，加入50 mL 50%乙醇，加入0.2 g乙二胺四乙酸钠，于60 ℃水浴中振荡反应至沉淀完全溶解。减压干燥，再加25 mL甲醇溶解，过滤，滤液减压干燥，得到粗品。
精制：粗品以少量乙酸乙酯溶解，按照上述硅胶柱层析法得到银杏叶双黄酮样品。
3.2 银杏叶双黄酮成分的测定
采用高效液相色谱法测定上述样品中双黄酮的得率与纯度。
（1）色谱条件：Kromasil C18色谱柱（150.0 mm×4.6 mm，5 μm）；
流动相：甲醇-水-乙酸（85.0∶15.0∶0.8）；
流速：1.0 mL/h；
检测波长：330 nm；
柱温：30 ℃；
进样量：10 μL。
（2）标准曲线的绘制：分别取2、4、8、12、16 mg银杏叶双黄酮标准品，放入50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，充分溶解后进行液相检测。以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程。
（3）样品的准备：将银杏叶提取液经微孔滤膜过滤后进样；
上述两种纯化工艺所得样品分别以甲醇溶解，经微孔滤膜过滤后进样。
3.3 结果与讨论
按前述色谱条件进行检测，结果如图6所示。由图6可知，双黄酮的出峰时间在4.5 min，根据峰面积以及标准曲线的回归方程计算出双黄酮的纯度及得率。由表1可知，采用金属络合联合硅胶柱层析法所得样品中，银杏叶双黄酮的得率和纯度分别为0.18%和72.00%，相比直接柱层析法，损失较少，双黄酮的纯度也进一步提高。
图6 不同纯化工艺下的液相色谱图
表1 纯化工艺及提取液中双黄酮的得率和纯度比较
优化了表面活性剂联用超声酶解法提取银杏叶总黄酮，表面活性剂选用0.03 g/mL吐温20，纤维素酶用量为0.5 mg/mL，料液比为1∶50，提取时间为70 min，总黄酮的得率达到1.207%。在此基础上，采用金属络合联合硅胶柱层析法纯化得到银杏叶双黄酮，纯度得到大幅提升，得率也有所提升。此方法成本低、速度快，可为银杏叶双黄酮的开发利用奠定基础。
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