日本血吸虫PROHIBITIN,2克隆和表达及免疫保护效果评估

杨珊珊，杨静云，张 旻，张 倩，何 静，黄明月，窦记晨，洪 炀，林矫矫，傅志强

（1.中国农业科学院上海兽医研究所 农业农村部动物寄生虫学重点实验室，上海 200241；
2.河南科技大学动物科技学院，洛阳 471000）

日本血吸虫病在我国长江流域及以南地区广泛流行，对疫区社会经济造成严重危害[1]。日本血吸虫在终末宿主人和哺乳动物体内发育成熟后主要寄生于肝门静脉和肠系膜静脉系，雌虫产生的虫卵主要沉积在肝脏和肠壁等组织中，刺激宿主产生肉芽肿病变，造成病理损害[2]。每对合抱的日本血吸虫在产卵高峰期每天可产1000～3000枚虫卵，重度感染时可造成人和家畜的死亡。对具有重要生理功能的蛋白的研究有助于对血吸虫病病原的深入了解[3]。

抗增殖蛋白（prohibitin, PHB）广泛分布于原生生物、植物和动物等多种生物的细胞中，进化上极其保守。McClung[4-5]分别在1989年首先报告了大鼠肝脏细胞和人成纤维细胞的抗恶性细胞增殖基因（antiproliferative gene），依据其编码蛋白具有明显的抵抗细胞增殖作用命名为抗增殖蛋白。研究表明，PHB突变可导致细胞无限增殖，多种肿瘤细胞与该蛋白表达异常相关，一般认为其编码基因是一种有效的肿瘤抑制基因[6]。PHB定位于线粒体、细胞核和细胞膜等部位，发挥或参与细胞的分化、增殖、衰老、凋亡及调控等多种生物学功能或生物进程，引起了广泛的关注[7-8]。

日本血吸虫的基因组和蛋白质组研究结果显示日本血吸虫有PHB基因和蛋白片段[9]。张旻等[10]在日本血吸虫体被蛋白中也鉴定到PHB蛋白片段，我们推测日本血吸虫PHB基因在维持体表完整上发挥了重要作用。本文应用RT-PCR和RACE克隆了SjPHB2基因，比较分析了其序列，在大肠杆菌系统中表达了rSjPHB2融合蛋白，并在小鼠日本血吸虫病模型中评估了其作为疫苗候选分子的潜力。

1.1 实验动物及生物材料雄性BALB/c小鼠（6周龄，25g）购自上海杰思捷实验动物有限责任公司；
日本血吸虫（中国大陆株）尾蚴由中国农业科学院上海兽医研究所血吸虫组钉螺室提供；
原核表达载体pGEX-4T-1由上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点实验室保存；
感受态E. coliDH5α和BL21（DE3）购自天根生化科技（北京）有限公司；
引物合成和测序分析均由上海桑尼生物科技有限公司完成。

1.2 主要试剂TRIzol购自Invitrogen公司；
ExTaqD N A聚合酶、小量质粒提取试剂盒、质粒pMD19-T、限制性内切酶XhoⅠ、EcoRⅠ、T4 DNA连接酶、3"-Full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒、PrimeScriptTMRT reagent Kit With gDNA Eraser反转录试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒等购自宝生物工程（大连）有限公司；
DNA marker DM2000、DM5000和TMB显色试剂盒购自上海天根生物科技有限公司；
辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）购自abcam生物工程公司。

1.3 日本血吸虫42 d成虫cDNA的合成新西兰白兔用腹部贴片法感染日本血吸虫尾蚴2000条，感染42 d后剖杀，应用肝门静脉灌注法收集虫体，用PBS充分洗涤去除粘附的宿主组织后，冻存于液氮备用。取液氮保存的日本血吸虫42 d成虫，利用TRIzol法提取虫体的总RNA，根据PrimeScriptTMRT reagent Kit With gDNA Eraser反转录试剂盒说明书方法合成虫体cDNA，将产物保存于-20℃。

1.4 SjPHB2基因克隆将GenBank公布的SjPHB2的cDNA片段序列进行拼接，获得预测的电子克隆序列。根据该序列，利用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物，SjPHB2-F：5"-CCGAT GTCAAAACTCTGC-3"，SjPHB2-R：5"-ATCG AATTTGGGGTCAG-3"。以1.2中合成的日本血吸虫cDNA为模板，PCR扩增得到SjPHB2基因片段并进行序列测定。

根据序列测定结果设计两个特异性引物并使用3"-Full RACE Core Set Ver.2.0 (TaKaRa)试剂盒扩增3"端序列。特异性外侧引物序列为：5"-CAAAACTCTGCGGTACG-3"，特异性内侧引物序列为：5"-ATGGAGGTCATCGAG CAATTATG-3"。3"RACE反转录的反应体系及程序参照说明书进行，随后进行套式PCR，经过Outer PCR和Inner PCR，将扩增到的3"端DNA片段胶回收并测序。最后通过融合PCR扩增完整的SjPHB2基因片段。

1.5 生物信息学分析对SjPHB2核酸序列和其编码氨基酸序列进行生物信息学分析，相关软件及网址见表1。

表1 相关生物信息学分析软件及网址Table 1 Related bioinformatics analysis software and website

1.6 rSjPHB2重组表达及纯化根据获得的SjPHB2完整序列设计引物，以前述融合PCR产物为模板，扩增SjPHB2基因的ORF。上游引物为：5"-CCGGAATTCATGTCAAAACTCTGC-3"（下划线处为EcoRⅠ酶切位点），下游引物为：5"-CCGCTCGAGGGATTTGTTGACCTGAT-3"（下划线处为XhoⅠ酶切位点）。用EcoRⅠ和XhoⅠ酶将PCR产物亚克隆到pGEX-4T-1载体构建重组表达质粒pGEX-4T-1-SjPHB2，并转化E. coliBL21（DE3），LB固体培养基上涂板培养，挑取单个菌落进行PCR和测序鉴定。将鉴定后的菌株接种LB培养基，37℃、250 rpm培养至细菌生长对数期（OD600为0.4～0.6），加终浓度为1 mmol/L的IPTG，37℃下诱导8 h，离心收集菌体，加入8 mol/L尿素裂解，再利用SDS-PAGE切胶回收纯化重组蛋白rSjPHB2，最后用BCA试剂盒测定重组蛋白浓度。

1.7 Western blot分析将rSjPHB2重组蛋白按常规方法免疫小鼠制备免疫血清。将重组蛋白rSjPHB2进行10%SDS-PAGE凝胶电泳，然后电转到硝酸纤维素膜上（Millipore），用5%脱脂奶室温封闭2 h后，分别与小鼠正常血清、rSjPHB2免疫血清和Anti-GST单克隆抗体在4℃孵育过夜。用含有0.05%Tween-20的PBST洗涤5次后，将膜与HRP偶联的山羊抗小鼠抗体室温孵育1 h。最后用ECL化学发光法（新赛美）进行显色观察结果。

1.8 重组蛋白rSjPHB2的动物保护实验将雄性BALB/c小鼠随机分为3组，PBS组、206佐剂组和rSjPHB2免疫组，每组10只。以ISA206为佐剂，将纯化的重组蛋白rSjPHB2按每鼠每次20 μg（100 μL）剂量背部皮下多点注射免疫小鼠，共免疫3次，免疫间隔2周。PBS组和206佐剂组分别按同样方法注射同等体积的PBS和ISA206。在3免后第14 d，采用腹部贴片法每只小鼠感染40±2条日本血吸虫尾蚴。感染后42 d剖检小鼠，采用肝门静脉灌洗法收集虫体并计数；
同时收集每只小鼠的肝脏称重，用10%NaOH消化后进行虫卵计数。按以下公式计算减虫（卵）率:减虫（卵）率＝[对照组平均虫荷（卵）数-试验组平均虫荷（卵）数）]/对照组平均虫荷（卵）数。

分别于免疫前、免疫后、感染后42 d采集各组动物血清，用ELISA分析抗rSjPHB2特异的IgG抗体水平。将纯化的rSjPHB2以1 μg/孔4℃过夜包被，之后用0.1%BSA（PBST）在37℃封闭1 h，然后加入待测血清，37℃孵育2 h，用PBST溶液洗3次后用含有HRP标记的山羊抗小鼠IgG，在37℃孵育2 h，再次用PBST溶液洗涤3次后用TMB溶液室温显色5 min，最后用2 mol/L H2SO450 μL/孔终止显色并用酶标仪读取450 nm处光吸收值。

1.9 统计学分析样本数据差异显著性比较采用t检验。

2.1 SjPHB2基因的克隆及序列分析依据电子序列设计的引物和日本血吸虫成虫cDNA为模板，PCR扩增得到870 bp基因片段（图1左），但测序结果显示该片段不是完整的ORF，缺少3"端结构。将该片段与3"RACE获得的片段进行融合PCR，获得了SjPHB2基因，该片段全长970 bp（图1右），其中SjPHB2的ORF为900 bp，编码299个氨基酸，理论等电点为9.92，预测分子量为33 kDa。42～203氨基酸位点为该蛋白的保守结构域，属于PHB家族。不具有信号肽，有一个跨膜区（图2）。

图1 SjPHB2基因的PCR产物Fig.1 PCR products of SjPHB2 gene

图2 SjPHB2氨基酸序列的跨膜结构域Fig.2 Transmembrane domains of the SjPHB2 protein

2.2 氨基酸序列同源性分析及系统进化树构建通过BLAST在线程序对SjPHB2氨基酸序列进行同源性分析，结果与人的PHB序列的相似性最高为73%，与秀丽隐杆线虫等5个物种的PHB氨基酸序列与SjPHB2的相似性为50.59%～72%（表2），比对分析结果可知，图中黑色阴影标示的氨基酸残基完全相同，是高度保守位点（图3）。应用Clustalx、MEGA软件进行多重比对分析并且构建系统进化发育树，结果可知，该基因与秀丽隐杆线虫PHB2的亲缘关系较近（图4）。

图3 不同物种间PHB氨基酸序列的同源性分析Fig.3 Analysis of homology of the amino acid sequence of PHB between different species

图4 不同物种PHB氨基酸序列的进化树分析Fig.4 Analysis of phylogenetic trees of different PHB amino acid sequences

表2 不同物种PHB2氨基酸序列相似性分析Table 2 Similarity analysis of PHB2 amino acid sequences of different species

2.3 rSjPHB2融合蛋白的表达与免疫原性分析将pGEX-4T-1-SjPHB2重组表达质粒转入E. coliBL21（DE3）中，用IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳。结果显示，rSjPHB2蛋白分子量约为59 kDa（图5A），融合蛋白以包涵体的形式存在。利用切胶回收获得rSjPHB2融合蛋白。

图5 rSjPHB2融合蛋白的分析Fig.5 Analysis of fusion protein rSjPHB2

以rSjPHB2为抗原，以GST标签单克隆抗体、重组蛋白rSjPHB2免疫小鼠血清和阴性小鼠血清为一抗，分别进行Western blot分析。结果显示rSjPHB2融合蛋白可以被GST标签单克隆抗体和rSjPHB2免疫小鼠血清识别（图5B），说明rSjPHB2有较好的免疫原性。

2.4 免疫保护效果评估ELISA检测小鼠血清抗rSjPHB2特异性IgG抗体水平的变化，结果可知。rSjPHB2蛋白免疫后，rSjPHB2特异性IgG抗体水平大幅提升，并维持在较高水平。206佐剂组和PBS对照组的特异性IgG抗体水平在免疫过程中尾蚴攻击前都维持在较低水平（图6）。小鼠日本血吸虫病免疫试保护试验结果可知，PBS对照组平均虫体数是16±7.952条/鼠，虫体发育率为约40%。rSjPHB2免疫组与PBS组相比，虫荷数没有减少，每克肝脏虫卵数减少25%，但差异不显著（表3）。

图6 ELISA检测rSjPHB2特异性抗体水平Fig.6 ELISA analysis of rSjPHB2 specific antibody

表3 rSjPHB2免疫BALB/c小鼠诱导的保护效果Table 3 rSjPHB2 induces immune protection induced by rSjPHB2 vaccination in BALB/c mice

PHB属于Stomatin-prohibitin-flotillin-HflC/K（SPFH）蛋白家族，在细菌、原虫、酵母等多种生物细胞中广泛分布。PHB由同源亚型PHB1和PHB2组成，具有共同的PHB结构域，通常锚定在真核细胞的细胞膜中，包括线粒体膜[11]。最初研究表明PHBs可能与细胞周期和增殖的调节有关[12]，后续发现该蛋白可能有多种生物功能，并且与越来越多的细胞过程有关，例如凋亡，转录控制，细胞信号传导，衰老和线粒体的生物过程[13-14]。本文克隆了日本血吸虫SjPHB2基因，其编码氨基酸序列中含有PHB结构域，与人及其他物种的同系物有较高的同源性，说明血吸虫PHB可能有相似的生物学功能。

多个研究表明，PHB在利什曼原虫[16]、细粒棘球绦虫[18]、布氏锥虫[19]、科罗拉多马铃薯甲虫幼虫[20]等寄生生物中具有重要的功能，是维持生物体组织形态和重要生理功能的基础蛋白。在模式动物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans）中，PHB定位于线粒体并且与线虫的衰老相关，敲除PHB1和PHB2可导致复制寿命缩短和线粒体膜电位的缺陷[15]。Jain等[16]报道利什曼原虫PHB与哺乳动物有41%的相似性，主要集中在前鞭毛体和无鞭毛体的表面，通过GPI锚固定在膜上。锥虫（Trypanosoma-brucei）中PHB与ConA诱导的凋亡过程相关，参与细胞周期控制[17]。Zhong等[18]也在细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus）克隆并鉴定了PHB基因。在多个基因数据库中已经记录了曼氏血吸虫、日本血吸虫和埃及血吸虫等多种血吸虫的PHB基因片段序列，Cheng等[21]报道了日本血吸虫在结构和进化上保守的PHB1基因，利用real-time PCR检测到SjPHB1在雌性蠕虫的卵黄腺中高度转录。通过RNAi在体内实现SjPHB1敲低导致虫体生长受阻，配对减少，并减弱了蠕虫对宿主的致病性。本文在克隆日本血吸虫SjPHB基因的基础上利用大肠杆菌中表达了rSjPHB2蛋白，为今后开展日本血吸虫PHB基因的功能研究提供了基础。

本文获得的rSjPHB2虽然有较强的免疫原性，免疫小鼠能诱导较高的特异性IgG抗体水平，但免疫诱导的保护效果不佳。日本血吸虫PHB与其他物种PHB类似，存在一个同源亚型分子PHB1，两者生物学功能可能存在互补或调节作用。今后可尝试开展日本血吸虫的SjPHB1和SjPHB2的联合免疫保护效果评估工作。

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