陈星竹, 于明岳, 刘 双, 李佳凝, 谢尊玄, 刘金瑶, 刘玉艳
（吉林大学口腔医院牙体牙髓科, 吉林 长春 130021）
龋病是发生在牙体硬组织的慢性感染性疾病, 被列为人类重点防治疾病之一。根据全球疾病负担研究[1］报告显示：龋病的患病率位居所有疾病之首并影响31 亿人的口腔健康。氟化物被认为是最有效的防龋药物, 其主要通过促进再矿化、抑制脱矿、干扰细菌代谢和菌斑形成发挥作用[2-3］。目前, 临床中常见的氟化物制剂主要包括氟化泡沫、含氟凝胶和氟保护漆等, 但上述氟化物制剂需定期由专业人员操作使用, 步骤较为繁琐且过高浓度的氟化物可能会引起不良反应[4-6］, 因此, 研制具有靶向性且低浓度给药的缓释型制剂是目前开发含氟制剂的方向。
以聚合物作为载体的药物缓释系统在口腔领域的应用越来越广泛, 该给药方式能够提高药物利用率、减少药物不良反应和给药频次[7］。聚碳酸丙烯酯[poly （propylene carbonate）, PPC］ 是由环氧丙烷和二氧化碳共聚而成的一种脂肪族聚酯, 由于其具有优异的生物可降解性和生物相容性, 被广泛应用于组织工程、医疗用品、药物缓释系统、药物递送系统和医用内植入材料等领域[8-12］。其中, PPC 在药物递送系统领域的相关报道主要集中于成骨领域, 而在再矿化领域中的报道较少。有研究[13-14］显示：PPC 的玻璃化转变温度Tg处于口腔温度范围内, PPC 与牙面接触后, 导致分子链段的活跃度增强, 从而使得负载其内部的药物释放且具有自黏性, 所以PPC 具有应用于口腔领域载体的潜质。因此, 研制以PPC 作为氟化物载体的牙贴片, 并将其应用于再矿化领域对实现氟化物的靶向及缓慢释放、提高氟化物利用率以及减少不良反应等方面将有重要意义。本研究采用熔融共混法制备合成不同氟含量的载氟聚碳酸丙烯酯（PPC/NaF）牙贴片, 并探讨不同氟含量牙贴片的再矿化性能和细胞毒性, 为指导PPC/NaF 牙贴片在临床上的应用提供依据。
1.1 细胞、主要试剂和仪器
小鼠成纤维L929 细胞由吉林大学实验室提供。PPC（Mn=60 000） 由中国科学院长春应用化学研究所提供。CCK-8 试剂盒由苏州新赛美生物科技有限公司提供, DMEM 培养液、胎牛血清（fetal bovine serum, FBS） 和青链霉素双抗（美国Hyclone 生物化学制品有限公司）, 人工唾液：氯化镁（MgCl2） 0.2 mmol·L-1、氯 化 钙（CaCl2）1 mmol·L-1、二 水 磷 酸 二 氢 钠（Na2HPO4·2H2O）4 mmol·L-1、氯 化 钾（KCl） 16 mmol·L-1、氯 化铵（NH4Cl） 4.5 mmol·L-1、 HEPES 缓 冲 液20 mmol·L-1, pH 为6.8, 脱 矿 液：
CaCl212 mmol·L-1、磷酸二氢钾（KH2PO4）10 mmol·L-1、乳 酸50 mmol·L-1、 KCl 100 mmol·L-1, pH 为4.5, 以上试剂购于国药化学试剂有限公司。XSS-300 型转矩流变仪（上海科创橡塑机械设备有限公司）, 电动加硫成型机（东莞市宝轮精密检测机器有限公司）, 恒温震荡仪（上海柯淮仪器有限公司）、 CO2细 胞 培 养 箱（美 国 Thermo Fisher Scientific 公司）、酶标仪（美国BioTek 公司）、扫描 电 子 显 微 镜 （scanning electron microscope, SEM）（广州仪德精密科学仪器股份有限公司）, 显微硬度仪（上海恒一精密仪器有限公司）。
1.2 PPC/NaF 膜的制备
制备前先将NaF 粉末80 ℃下干燥24 h, PPC颗粒在60 ℃下干燥12 h。按配比（质量分数0.5%、2.5%和5.0%）准确称量NaF 粉末和PPC颗粒并将二者均匀混合, 置于扭矩流变仪中150 ℃搅拌10 min 得到共聚物。随后, 采用电动加硫成型机将其压制成载薄膜。
1.3 再矿化试验
1.3.1 釉质试件准备 本试验经本院伦理委员会批准。在本院颌面外科门诊收集近3 个月因正畸或牙周病而拔除的前磨牙和磨牙, 保存于4 ℃、3%的戊二醛中。入选标准：试验所用牙齿要求肉眼下牙体表面釉质完整、无龋坏、无白斑、无缺损、未行牙体和牙髓治疗。采用刮治器清除牙冠表面的色素、牙结石和牙根上附着的软组织。在流水状态下采用碳化硅砂纸逐级打磨牙面至镜面状, 超声震荡清洗。选择釉质颊侧平滑面制备成3 mm×3 mm×4 mm 的釉质块。采用抗酸性指甲油对除颊面之外的牙面进行双层封闭, 保存于4 ℃去离子水中备用。1.3.2 人工龋模型的制备 将筛选好的釉质样本置于人工脱矿液中, 釉质表面与脱矿液的比率为20 mm2·10 mL－1, 每天更换新鲜配制的脱矿液。脱矿实验在恒温震荡箱中进行, 共计96 h, 脱矿实验结束后, 将釉质样本用去离子水超声清洗30 min 后待用。
1.3.3 试验分组和处理 将经脱矿处理的试件随机分成PPC 组、0.5%PPC/NaF 组、2.5%PPC/NaF 组和5.0%PPC/NaF 组, 每组各10 个样本。预先将PPC/NaF 膜剪裁成3 mm×3 mm 的小块, 贴在釉质试件表面。在人工唾液中浸泡12 h 后, 去除贴片, 再次置于人工唾液中12 h。上述过程重复3 周, 再矿化过程在37 ℃恒温震荡箱中完成。
1.3.4 显微硬度检测 釉质试件脱矿处理前后和再矿化处理后, 采用显微硬度仪（knoop 压头, 50 g、15 s）垂直于釉质表面随机测量5 个点且每点间隔100 μm, 去除最大值和最小值后求显微硬度的平均值。根据公式计算显微硬度恢复百分比（surface microhardness recovery, SMHR）：SMHR=（SMH2-SMH1）/（SMH0-SMH1）×100%。SMH0表示基线表面显微硬度；
SMH1表示脱矿试验后的表面显微硬度值；
SMH2表示再矿化后表面显微硬度。
1.3.5 SEM 观察釉质试件表面形态表现 每组釉质试件随机选取1 枚用于检测, 釉质块干燥、喷金、镀膜。SEM 在5 kV 真空状态下于高倍镜下（×2 000 或×5 000）观察釉质试件表面形态表现。
1.4 体外细胞毒性实验
1.4.1 浸提液制备和处理 将制备好的PPC/NaF牙贴片剪裁成6 cm×10 cm 小块, 经紫外线照射灭菌1 h。每个牙贴片试件浸于含1%FBS 的DEME高糖培养基中, 置于37 ℃细胞培养箱24 h, 过滤除菌后保存于4 ℃冰箱中备用。
1.4.2 CCK-8 实验检测各组细胞相对增殖率（relative growth rate, RGR）将小鼠成纤维L929 细胞接种至96 孔细胞培养板（每孔5 000 个）, 置入37 ℃细胞培养箱中培养24 h。细胞分为实验组（PPC 组、0.5%PPC/NaF 组、2.5%PPC/NaF 组和5.0%PPC/NaF 组）和空白对照组。待细胞贴壁后, 实验组分别加入各组贴片浸提液100 μL, 以采用DMEM 培养基作为空白对照组, 每组平行培养3 孔, 培养板置于细胞培养箱内培养48 h；
更换培养 基, 每 孔 加 入10 μL CCK-8 试 剂 和100 μL DMEM 培养基, 孵育2 h。采用酶标仪于450 nm 波长处检测吸光度（A） 值。根据A 值计算RGR。RGR＝实验组A 值/空白对照组A 值×100%, 细胞毒性分级：RGR≥100%, 为0级；
75%≤RGR＜100%, 为 1 级；
50%≤RGR＜75%, 为 2 级, 25%≤RGR＜50%, 为3 级；
0%＜RGR＜25%, 为4 级；
RGR=0, 为5 级。
1.5 统计学分析
采用SPSS 26.0 统计软件进行统计学分析。各组釉质试样的显微硬度值和RGR 均符合正态分布, 以±s表示, 多组间样本均数比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 各组釉质试件的显微硬度值
各组釉质试件的SMH0比较差异无统计学意义（P＞0.05）；
脱矿处理后所有组别釉质试件的SMH1均明显降低（P＜0.05）。经不同氟含量PPC/NaF 牙贴片处理后, 各组试件SMH2均高于处理前（P＜0.05）, 但仍低于脱矿前（P＜0.05）。5.0%PPC/NaF 组釉质试件的SMHR 最高达77.11%, 各组釉质试件的SMHR 由低到高依次 为 0.5%PPC/NaF 组、 2.5%PPC/NaF 组、5.0%PPC/NaF 组和PPC 组。脱矿前后和再矿化后各组釉质试件釉质表面显微硬度值见表1。
表1 脱矿前后和再矿化后各组釉质试件的SMH0、SMH1、SMH2 和SMHRTab. 1 SMH0, SMH1, SMH2, and SMHR of enamel samples in various groups before and after demineralization and after remineralization (n=8, x±s·）
2.2 各组釉质试件表面形态表现
正常釉质试件表面均匀、平坦, 可见一些凹坑及划痕（图1A 和1B）。经酸蚀后、釉质试件表面粗糙, 存在散在的孔隙及裂纹, 釉柱中心和釉柱间隔晶体出现明显溶解（图1C 和1D）。PPC 组釉质试件表面可见不规则的颗粒状沉积物, 分布不均匀, 但仍可见不规则的孔隙和裂纹（图1E 和1F）。0.5%PPC/NaF 组釉质试件表面孔隙明显减少, 但表面仍可见明显釉质塌陷且晶体沉积疏松, 不均匀（图1G 和1H）。2.5% PPC/NaF 组釉质试件表面几乎不见孔隙, 表面较为规则并覆盖大量针状晶体, 排 列 密 集 紧 凑（图1I 和1J）。5.0%PPC/NaF 组釉质试件表面覆盖针状或不规则颗粒状的晶体, 有些区域可见层状沉积物（图1K 和1L）。
图1 SEM 观察各组釉质试件表面形态表现Fig.1 Morphology of surface of enamel samples in various groups observed by SEM
2.3 各组小鼠成纤维L929 细胞RGR 和细胞毒性等级
随着加入PPC/NaF 牙贴片中药物含量的增加, 各组RGR 值均呈现降低趋势。除5.0%PPC/NaF组小鼠成纤维L929 细胞的RGR 与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）外, 其余各组小鼠成纤维L929 细胞RGR 与空白对照组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。各组小鼠成纤维L929 细胞采用不同氟含量的PPC/NaF 牙贴片处理后的RGR 均大于75%, 细 胞 毒 性 等 级 为0 级或1 级。见表2。
表2 各组小鼠成纤维L929 细胞RGR 和细胞毒性等级Tab. 2 RGR and cytotoxicity grades of fibroblast L929 cells of mice in various groups
釉质是非细胞组织, 一旦受损无修复和再生能力, 因此对釉质脱矿的早期预防和促进脱矿釉质再矿化是目前临床上研究的热点及难点[15-16］。正常生理状态下, 釉质的脱矿和再矿化处于动态平衡。附着在釉质表面的牙菌斑代谢产酸使口腔环境内pH 值低于临界值, 导致釉质晶体脱矿和再矿化失衡[17-18］。氟化物的应用能够逆转失衡, 促进脱矿的釉质发生再矿化。在正常生理条件下, 口腔微环境中氟浓度较低, 采用氟化物后, 经吞咽后残留的氟化物可被唾液稀释并与牙石、牙菌斑、釉质和口腔软组织结合形成氟库[19］。研究[20］显示：定期应用氟化物会使得口腔环境中氟离子水平持续升高, 而当口腔唾液中持续存在低水平的氟离子时, 氟化物的抗龋效果更为显著。传统局部含氟产品（含氟牙膏和漱口水等）与牙面接触时间过短导致氟化物的利用效能低, 因此需长期高频使用[4］。高浓度氟制剂（氟化凝胶和涂膜等）需定期由专业人员操作使用且过高浓度的氟化物可能会增加氟牙症和耐氟链球菌产生的风险[5-6］。因此, 研发操作便捷且安全高效的氟制剂具有重要现实意义。
采用高分子聚合物作为载体搭载氟化钠以缓释氟离子为预防龋病提供了一种新思路。生物黏附性膜剂可黏附于口腔黏膜并持续缓释氟离子, 但其舒适度较差, 易脱落且对黏膜有一定刺激性[21］。释氟性充填材料用于龋洞充填修复并能有效减少继发龋, 但其并不适用于对龋病的早期预防[22］。缓释型牙贴片不仅兼具黏附性和缓释性而且能够有效延长氟离子与牙面的作用时间, 可作为替代传统含氟制剂的新型防龋产品。PPC 的玻璃化转化温度Tg较低, 仅为35 ℃～40 ℃, 导致其力学性能和耐热性能不佳[23］, 但该温度处于口腔温度范围内, PPC 处于口腔环境中时, 分子链段的活跃度增加进而促进药物释放并且还具有一定黏性, 可作为负载药物的理想载体。本实验根据聚合物和药物的不同配比, 得到了不同NaF 含量的PPC/NaF 牙贴片, 该牙贴片采用熔融共混法制备, 即将药物与聚合物经机械搅拌后加热熔融并模压成型, 该方法操作简单、成本低廉。
釉质再矿化检测主要包括对釉质的硬度、表面形貌特征、元素种类和含量、机械性能及矿物含量等的评估。仅依靠单一评估方法不能保证所获结果的可靠性, 多种测量方法的结合应用和多角度分析可以扬长避短。本研究采用不同氟含量的PPC/NaF 牙贴片处理早期人工釉质龋模型, 采用显微硬度仪和SEM 评估不同氟含量的PPC/NaF 牙贴片的再矿化性能, 结果显示：与PPC 组比较, 不同配比PPC/NaF 组釉质试件的显微硬度值均有不同程度提高, 提示PPC/NaF 牙贴片可在一定程度上促进脱矿釉质发生再矿化。随着PPC/NaF 牙贴片中氟含量的增加, 釉质试件的显微硬度值和SMHR也增加, 这与其他研究[24］结果一致。尽管经各组PPC/NaF 牙贴片处理后, 脱矿釉质试件显微硬度值均有所提高, 但仍未恢复到脱矿前水平。这可能是由于矿物晶体在釉质表层快速沉积, 导致矿物离子难以达到釉质表层下, 从而导致釉质试件表面显微硬度值降低。
为进一步探讨PPC/NaF 牙贴片对脱矿釉质的再矿化作用, 采用SEM 对釉质试件表面形貌特征进行分析。本研究结果显示：健康釉质经脱矿处理后, 釉质表面呈现许多深浅不一的孔隙及裂纹。随着PPC/NaF 牙贴片中氟含量的增加, 釉质表面孔隙逐渐减少并可见大量针状和不规则状矿物晶体沉积于表面。PPC/NaF 牙贴片中的氟离子缓慢释放, 附着在脱矿釉质表面的氟离子与唾液接触后, 与钙离子结合形成氟磷灰石或氟化钙起到促进再矿化的作用[25-26］。PPC/NaF 牙贴片释放氟离子的机制：PPC/NaF 与周围介质的浓度梯度较大, 使得包封在PPC 膜表面和表面下层的氟化物迅速释放；
随着浓度梯度减小, 处于PPC 膜内部的氟化物缓慢而持续地向外扩散；
当PPC 处于口腔环境中时, 分子链的加速运动也促进了氟离子的释放。本研究结果显示：PPC 组试件中也可观察到少量晶体生成, 这主要由于人工唾液中钙、磷酸盐离子在釉质脱矿表面沉积, 但该组表面仍可见大量孔隙, 这说明唾液的再矿化能力极为有限, 局部应用氟化物十分必要[27-29］。
当氟元素摄入在正常生理需求量时, 有利于保证机体对钙磷的正常代谢, 预防龋病和动脉硬化。若长期摄入过量的氟会导致氟中毒, 引起骨相组织、肝、肾、生殖系统和神经系统等多方面的损伤[30-31］。本研究将小鼠成纤维L929 细胞与PPC/NaF 牙贴片浸提液进行共培养, 分析不同氟含量PPC/NaF 牙贴片的细胞毒性, 结果显示：氟浓度在0.5%～5.0%时, 随着浓度的增加, RGR 逐渐降低, 但毒性评级均为1 级, 说明PPC/NaF 牙贴片无细胞毒性。PPC 组对小鼠成纤维L929 细胞的毒性评级为0 级, 表示PPC 为一种安全的生物材料。研究[8］显示：PPC 在降解过程中不会产生酸性物质, 因此不会对口腔黏膜造成任何刺激。此外, PPC/NaF 牙贴片柔软、舒适, 具有良好的贴合性, 极大提高了患者的接受程度。
综上所述, 本实验合成的PPC/NaF 牙贴片能够促进脱矿釉质再矿化且无细胞毒性。PPC/NaF牙贴片为生物降解材料在龋病防治的应用方面开辟了新思路, 具有潜在的经济效益和社会效益。
猜你喜欢釉质氟化物贴片铅锌冶炼行业高氟碱性废水除氟技术研究价值工程(2022年19期)2022-06-14柚皮苷对早期釉质龋再矿化的影响口腔医学(2021年10期)2021-12-02釉质形成相关基因多态性与龋易感性关系的研究进展口腔疾病防治(2020年2期)2020-02-26茶包含氟化物过多会损害骨骼甚至致癌饮食保健(2019年15期)2019-08-13心脏细胞微针贴片，可治疗心肌梗死东西南北(2019年6期)2019-04-30皮肤贴片对花生过敏有帮助基础医学与临床(2018年11期)2018-02-13微型的皮肤贴片 让你不运动就能减肥小康(2017年34期)2017-12-08不同浓度锌的含氟矿化液对人恒前磨牙釉质脱矿影响的体外研究医学研究杂志(2015年9期)2015-07-01磷肥厂氟化物对周边农作物的危害与防治云南化工(2015年4期)2015-01-11武钢成国内首家开发贴片支架用精密钢带企业天津冶金(2014年4期)2014-02-28