段鸿斌，杨立军，罗 伟，崔晨旭，高 涵，陈 重
(信阳农林学院 制药工程学院， 河南 信阳 464000)
铁线蕨(Adiantumcapillus-venerisL.)是铁线蕨科铁线蕨属草本植物，又名猪毛七、岩棕、铁线草等，其分布广泛，具有较高的药用和食用价值[1-2]，众多研究表明,铁线蕨具有抑菌[3]、抗氧化[4]、降血糖[5]等多种药理作用。此外，铁线蕨中还含有丰富的黄酮类[6]、酚类[7]、三萜类[8]等生物活性成分，这些物质在食品工业[9]、医药等行业[10]中具有重要的应用潜力。
植物内生菌(Endophytes)是寄生于活体植物各组织和器官内的，且不会引起明显的宿主植物外在感染症状的微生物。从药用植物中分离得到的内生菌的次级代谢物含有许多与宿主植物相同或相似的生物活性物质；
它们还具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤等多种药理作用[11]，对药用植物内生菌的研究有着重大的科学意义和现实的实用意义[12]。然而,目前对于铁线蕨化学成分与药理作用等的研究均停留在植株本身[1]，蕨类植物中内生菌资源丰富[13]，但对铁线蕨内生菌及其次级代谢产物活性的研究却未见相关报道。
本研究从铁线蕨根部分离出一株内生真菌，结合形态学和分子生物学手段对其进行鉴定，并对其抑菌与抗氧化能力进行了初步研究，为进一步研究和开发其活性产物作为天然抑菌剂、抗氧化剂奠定基础，为扩展优质、高效食品防腐剂的品种来源提供依据。
1.1 试验材料
铁线蕨于2021年4月采集于河南省信阳市大别山地区，经信阳农林学院陈琼教授鉴定为铁线蕨(Adiantumcapillus-venerisL.)。将新鲜、健康的铁线蕨清洗干净，外覆保鲜膜，4 ℃保存于信阳农林学院微生物实验室。
1.2 材料与仪器
Solarbio真菌基因组DNA提取试剂盒D2300，广州索莱宝生物科技有限公司；
1,1-二苯基-2-三硝基苦肼(DPPH)，合肥千盛生物科技有限公司；
2,2-联氨-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)标准品，得研实验生物耗材有限公司；
过硫酸钾，上海麦克林生化科技有限公司；
大肠埃希菌(Escherichiacoli)、沙门氏菌(Salmonella)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，信阳农林学院微生物实验室；
旋转蒸发器，RE-2000A型，郑州贝楷仪器设备有限公司；
恒温培养箱，BS-1E(A)型，上海精密仪器仪表有限公司；
落地式洁净工作台，SW-CJ-2F型，上海力辰邦西仪器科技有限公司；
酶标仪，DNM-9602型，北京普朗新技术有限公司；
电热式压力蒸汽灭菌锅，XFH-75CA型，浙江新丰医疗器械有限公司。
1.3 内生真菌的分离
根据文献[14]分离铁线蕨内生真菌。
1.4 菌株鉴定
1.4.1 菌株的分子鉴定
根据文献[15]修改如下：采用Solarbio真菌基因组DNA提取试剂盒D2300(广州索莱宝生物科技有限公司)提取真菌DNA，提取合格的DNA进行rDNA-ITS的PCR扩增。PCR反应体系为20 μL，包括引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGC-3’)和ITS4(5’-TCCTCCTTATTGATATGC-3’)各1 μL，2×Taq Master Mix混合物(包括蓝色染料)10 μL，基因组DNA 1 μL和ddH2O 7 μL。反应条件：在98 ℃预变性30 s，在98 ℃下变性10 s，在55 ℃退火30 s，在72 ℃下延伸1 min，30个循环，最终在72 ℃下延伸5 min，在4 ℃下储存。经过1.8%琼脂糖凝胶电泳检测，合格的PCR产品被送往检测公司进行测序，获取基因序列。将获取的ITS序列提交至NCBI网站，使用BLAST程序进行比较，然后在MEGA程序中使用邻接连接，参考FELSENSTEIN等[16]的最大似然法构建系统发育树。
1.4.2 菌株的形态学鉴定
挑取纯化后的内生真菌菌丝，接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，28 ℃黑暗条件下培养3～7 d，观察记录菌落形状、颜色、生长速度以及菌落的质地。挑取菌丝，结晶紫染色，然后在显微镜下观察菌丝和孢子的特征，并根据《真菌鉴定手册》[17]进行初步鉴定。
1.5 次级代谢产物的提取
无菌条件下，将生长在PDA固体培养基中的活化菌株接种到PDB液体培养基中，置于恒温震荡培养箱内，28 ℃、150 r/min培养4 d作为种子液备用。将种子液按4%的接种量接种于PDB液体培养基中，28 ℃、150 r/min恒温震荡培养4～6 d得到发酵液。取发酵结束后的发酵液，八层纱布过滤，除去菌丝体，合并滤液，用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，将萃取液减压蒸干浓缩得到粗浸膏，用甲醇配制成50 g/L的样液。
1.6 抑菌活性研究
1.6.1 供试菌液的制备
在无菌环境下，取出保存的供试病原细菌，用平板划线法接种在灭菌后的NA培养基上，37 ℃活化培养18～24 h后，挑取部分菌落接种在灭菌后的NB培养基中，置于恒温振荡器中37 ℃，200 r/min培养18～24 h。无菌操作条件下，采用麦氏比浊法，用无菌水将细菌原液稀释成波长600 nm下OD值为0.2(约1×108CFU/mL)的供试菌液。
1.6.2 含菌平板的制备
无菌环境下，取200 μL的供试菌液，用涂布棒将菌液均匀涂布于NA培养基平板，倒置备用。
1.6.3 抑菌试验
用打孔器将无菌滤纸制成直径为6 mm的圆纸片，取20 μL的样液滴加到滤纸片上，吹干，然后将纸片贴在含大肠埃希菌(Escherichiacoli)、沙门氏菌(Salmonella)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)平板上。革兰氏细菌平板的阳性与阴性对照分别为含500 mg/L的青霉素溶液、链霉素溶液的滤纸片；
滴加甲醇溶液的滤纸片为空白对照置于37 ℃培养箱中培养18～24 h，采用十字交叉法测量抑菌圈直径，取平均值。
1.6.4 MIC 和 MBC 值的测定
根据文献[18]与[19]修改如下：以仅含LB的液体培养基为阴性对照(NC)，在培养箱中37 ℃保温24 h。通过观察孔内溶液的清晰度来判断抑制效果，将处于清晰与浑浊之间的浓度定为最低抑菌浓度(MIC)；
从澄清孔中分别吸取50 μL溶液涂布在LB平板上，并在37 ℃的培养箱中培养24 h，没有细菌生长的最小稀释浓度即为最低杀菌浓度(MBC)。
1.7 抗氧化活性研究
1.7.1 供试样品的制备
取50 g/L的样液，用甲醇将其分别配制成浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 g/L的溶液，4 ℃避光保存。同理，取适量抗坏血酸(Vc)，依次配置成上述浓度的溶液。现用现配，避光保存。
1.7.2 清除DPPH自由基能力测定
根据文献[20]测定清除DPPH自由基能力。
1.7.3 清除ABTS自由基能力测定
根据文献[21]的方法修改如下：分别吸取50 μL不同浓度的样品溶液，加入200 μL ABTS自由基工作液，摇匀，于酶标仪37 ℃孵育10 min，在734 nm处测定吸光度A1。按照相同方法，吸取50 μL样品溶液和200 μL蒸馏水(代替ABTS自由基工作液)，测定吸光度A2；
吸取50 μL蒸馏水(代替样品溶液)和200 μL ABTS自由基工作液，测定吸光度A0。以同等浓度梯度的Vc溶液作为阳性对照，以甲醇作为阴性对照。按照公式(1)计算ABTS自由基清除率。
ABTS自由基清除率=
(1)
1.7.4 清除羟基自由基能力测定
根据文献[22]测定清除羟基自由基能力。
1.8 数据处理
每组试验重复3次，使用Excel 2010、SPSS 26.0进行数据统计分析及绘图。
2.1 菌株鉴定结果
2.1.1 tg-1形态学鉴定结果
tg-1菌株的形态特征如图1(A)和图1(B)所示，tg-1菌株在PDA培养基上生长2～3 d后可看到新生菌丝，菌丝从中心向外依次由致密至疏松生长，菌落呈规则圆形。随菌龄的增加，菌落中心菌丝退化，逐渐出现深棕色孢子团，向外形成两个菌丝呈白色及深黄色的同心圆。取菌落中心孢子团，在光学显微镜下进行观察，如图1(C)所示，菌丝有隔膜，孢子形态呈椭球形。根据文献[17]，初步鉴定其为曲霉属(Aspergillussp.)。
图1 内生真菌tg-1的单菌落(A)、平板划线形态(B)、孢子形态(C)Fig. 1 Single colony(A)、plate streak(B) and spore morphology(C) of endophytic fungus tg-1
2.1.2 tg-1分子生物学鉴定结果
应用PCR扩增，获得tg-1内生菌的ITS序列，然后通过测序和基于BLAST的方法进行扩增。获得的序列显示对具有高身份(99%～100%)和高序列覆盖率(97%～100%)的数据库的命中率。选择最佳命中率以构建系统发育树(图2)。根据系统发育和BLAST分析，NCBI数据库中最接近的可用菌株属于曲霉属，最相似的菌株是Aspergillusterreus(99%序列同一性)。
2.2 抑菌试验结果
内生真菌tg-1次级代谢产物在含有大肠埃希菌(Escherichiacoli)、沙门氏菌(salmonella)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)等4种供试菌的平板上均出现了抑菌圈，表明其对供试菌具有不同程度的抑制作用(见表1)。对大肠埃希菌和沙门氏菌的抑制作用最强，这两种供试菌的抑菌圈直径分别为1.34±0.42、1.52±0.28 mm，接近阳性对照的一半。采用二倍稀释法分别测定内生菌对4种供试菌的MIC与MBC的数据如表1所示。
图2 基于ITS序列鉴定菌株的系统发育树
表1 内生真菌tg-1抑菌试验的结果
表1中MBC代表能够杀灭99.9%供试微生物时次级代谢产物的最低质量浓度，MIC是指能够杀灭培养基内约80%供试微生物时次级代谢产物的质量浓度，理论上MBC数值应偏大于MIC。表1中大肠埃希菌的MIC与MBC分别为0.781 5、3.125 0 g/L，二者相差较大，符合正确的试验结果。KHAN等[3]的研究发现铁线蕨属植物的提取液对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌病原体等其他革兰阴性菌有明显的抑菌作用，与本试验结果一致。
2.3 抗氧化试验结果
2.3.1 DPPH自由基清除能力
由图3可知，Vc对DPPH的清除能力很好，在0.02～0.12 g/L范围内Vc对DPPH自由基的清除率保持在97%以上，且受浓度的影响不大。在试验浓度范围0.02～0.12 g/L内，随着内生真菌tg-1次级代谢产物浓度的升高，其对DPPH自由基的清除率呈依赖性增长，当次级代谢产物的质量浓度达到0.12 g/L 时，其对DPPH的清除率高达88.46%，接近同等质量浓度下Vc对DPPH的清除率，相比于0.02 g/L质量浓度下仅为32.54%的清除率有了大幅度增长，这表明内生真菌tg-1次级代谢产物对DPPH有着极佳的清除能力。根据次级代谢产物质量浓度与对DPPH清除率的曲线的趋势进行预测，当次级代谢产物的质量浓度达到0.16 g/L时，它对DPPH的清除能力就将无限接近同等质量浓度下Vc的清除能力。根据回归方程，其IC50为0.038 g/L。
图3 内生真菌tg-1及Vc清除DPPH自由基的能力
2.3.2 ABTS自由基清除能力
由图4可知，在0.02～0.12 g/L范围内，tg-1次级代谢产物对ABTS自由基的清除能力随其质量浓度的增加而增大。当次级代谢产物的质量浓度小于0.08 g/L时，次级代谢产物对ABTS自由基的清除能力随质量浓度的增加明显增大，当质量浓度超过0.08 g/L时，次级代谢产物对ABTS自由基的清除能力随质量浓度增大而增加的增幅减慢。当次级代谢产物的质量浓度为0.02 g/L时，其ABTS自由基的清除率为49.29%，当质量浓度增加到0.12 g/L时，其对ABTS自由基的清除率高达98.05%，基本与同等质量浓度Vc的清除率相同。根据回归方程，其IC50为0.026 g/L。
图4 内生真菌tg-1及Vc清除ABTS自由基的能力
2.3.3 羟基自由基清除能力
由图5可知，在0.02～0.12 g/L范围内，Vc对羟基自由基的清除作用很好，受质量浓度的影响比较小，tg-1次级代谢产物对羟基自由基的清除作用呈一定的量效关系。
图5 内生真菌tg-1及Vc清除羟基自由基的能力
当次级代谢产物的质量浓度小于0.06 g/L时，次级代谢产物对羟基自由基的清除能力随质量浓度的增加而明显增大；
当质量浓度超过0.06 g/L时，次级代谢产物对羟基自由基的清除能力随质量浓度增大而增加的增幅减小。质量浓度从0.02 g/L增加到0.12 g/L时，tg-1次级代谢产物对羟基自由基的清除率从20.32%增加到84.15%，均明显低于同等质量浓度下Vc的清除能力。由此可见，相对于tg-1次级代谢产物对DPPH与ABTS自由基的清除能力，其对羟基自由基的清除能力较弱，这与田晓艳等[10]的研究结果相一致。根据回归方程，其IC50为0.063 g/L。
铁线蕨内生真菌菌株tg-1属于Aspergillussp.，此类菌是常见的植物内生真菌，该菌株虽表现出广谱的抑菌活性，但是MIC和MBC值不够理想，可能是由于代谢产物中多个物质之间相互作用对结果产生一定的干扰。此外，该菌株清除DPPH、ABTS、羟基自由基的IC50分别为0.038、0.026、0.063 g/L，在一定范围内有较好的抗氧化活性，与Vc相比，抗氧化效果相对较弱，可能是菌株发酵液中的某种物质对DPPH等自由基的清除效果造成了影响，或者是由于未进行菌株发酵条件的优化，无法达到菌株的最适生长条件，使得发酵液中的抗氧化物质浓度不高。为进一步追踪高活性物质来源，下一步应将tg-1作为目标菌株，对其发酵条件进行优化，通过批量发酵，利用化学手段进行结构鉴定，测定评价单体物质的抑菌和抗氧化活性，以筛选获得具有显著活性的单一化合物，为抑菌和抗氧化药物先导分子的挖掘提供备选药源。
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