刘歆阳 何梦江 陈巍峰 李全林 周平红△
（1复旦大学附属中山医院内镜中心 上海 200032；
2复旦大学附属中山厦门医院内镜中心 厦门 361015）
胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率位居所有恶性肿瘤的第四位，病死率位居第二位［1］。我国是胃癌的高发国家之一，发病数占全球42%［2］。胃癌的治疗主要采取以外科手术切除为主的综合治疗手段［3］，传统的治疗（包括手术、放疗及化疗）在早期胃癌的治疗上取得了一定进展，但对于诊断时已处于进展期、伴有深度浸润或淋巴结转移的胃癌患者，即使行根治性切除术，仍有40%～65%在术后发生复发或转移，而复发转移后放疗效果欠佳，生存时间较少超过一年，成为限制胃癌术后生存率的最关键因素。因此，探究胃癌的转移机制、鉴定针对性的治疗靶点迫在眉睫，具有重要的临床价值和社会意义，也是提高胃癌疗效的关键。
蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTP）的生物学功能是催化蛋白质的酪氨酸残基上的磷酸基团转移到三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）上，从而决定蛋白质的活化与否，影响生物学行为［4］。受体型酪氨酸磷酸 酶S（protein tyrosine phosphatase receptor S，PTPRS）作为PTP家族的重要分子，既往研究集中在神经发育［5］和自身免疫疾病［6］中。近年来PTPRS在肿瘤领域中的作用和机制也受到越来越多的关注，但PTPRS在胃癌中的作用及机制目前尚未见报道。本研究通过分析PTPRS与胃癌患者预后的关系，观察PTPRS对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响，并探讨其机制，从而为胃癌治疗新靶点的探索提供理论基础及实验依据。
实验材料PTPRS抗体、EMT相关通路抗体和HRP-标记二抗等购自美国Abcam、Cell Signaling Technology及Sigma公司。PTPRS（兔多抗，Novus，货号NBP2-92999，WB浓度1∶1 000；
兔多抗，Abcam，货号ab222798，IHC浓度1∶100）；
Actin（小鼠单抗，Sigma，货号A5441，WB浓度1∶2 000）；
N-cadherin（兔单抗，Abcam，货号ab76011，WB浓度1∶1 000）；
ASMA（兔单抗，Abcam，货号ab184705，WB浓度1∶500）；
Slug（兔多抗，Abcam，货号ab27568，WB浓度1∶500）；
Snail（兔单抗，Cell Signaling，货号3879，WB浓度1∶200）；
Vimentin（兔单抗，Abcam，货号ab92547，WB浓度1∶500）。PTPRS敲减慢病毒购自汉尹生物科技（上海）有限公司。DMEM培养基、RPMI 1640培养液和胎牛血清均购自美国Gibco公司；
CCK-8试剂盒购自日本同仁公司；
荧光定量PCR仪和凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司；
相机购自日本Canon公司；
荧光倒置显微镜购自日本Olympus公司。即用型快捷免疫组化MaxVisionTM2试剂盒、DAB显色试剂盒、苏木素体细胞快速染色液均购自福州迈新生物技术开发有限公司。Transwell小室及Matrigel PTMP Basement Membrane Matrix购自BD biosciences公司。本研究中使用的患者组织标本通过复旦大学附属中山医院伦理委员会批准（B2020-393R），获得研究对象知情同意。
利用组织芯片分析PTPRS在胃癌的表达情况及与临床病理因素的关系回顾性收集2013年1月—6月复旦大学附属中山医院手术切除的胃癌患者瘤体石蜡标本，并进行切片和HE染色，从组织学层面鉴定细胞形态和排列结构。每个蜡块均选取2个细胞形态典型，排列结构典型，无制作过程中挤压、开裂的组织位点，进行打孔排列，制作组织芯片。收集胃癌患者的基本临床信息（包括年龄、性别等）及相关临床病理特征（包括肿瘤大小、部位、分化程度等）。将信息录入Stata 14.0，与组织芯片位点一一对应，PTPRS蛋白进行免疫组化染色，利用ImageJ对组织芯片的照片进行处理，对于染色的深度和细胞的丰富程度等利用IHC Profiler软件进行打分，根据IHC Profiler分数的高低进行排序，以平均数进行分组，区分PTPRS高表达组和PTPRS低表达组［7］。两位研究者独立对于ImageJ评分的结果进行判定，对发现有问题的样本进行讨论，根据讨论结果确定高低表达组分类。对分组与胃癌临床病理特征进行相关性分析，并比较不同表达水平与患者生存及术后复发的相关性。
构建PTPRS干扰的稳转细胞株本实验采用的SGC7901和HGC27细胞系来源于复旦大学附属肿瘤医院，培养方法为DMEM+10%FBS。ShPTPRS的序列为5’-TACTTGGCACATTCCT-CCTTT-3’。ShRNA载体使用pcDNA 3.1，利用慢病毒包装试剂盒（吉凯基因，LPK001）在293T细胞中构建PTPRS干扰的慢病毒。在胃癌细胞系中转染构建好的慢病毒，利用荧光显微镜观察病毒自带的GFP绿色荧光了解转染效率，转染效率＜90%为重复转染。转染成功后利用qPCR和验证PTPRS表达水平变化。
CCK-8法检测细胞增殖胃癌细胞株使用含10%FBS的培养基；
取2 000个/孔（每孔100 μL）的浓度将处于对数期的细胞接种到96孔板，每孔设3个对照；
待细胞贴壁后，加入10 μL CCK-8检测液，温育2 h；
用自动酶标仪在450 nm波长处，测定各孔的吸光度（D）值。连测5天，最后取各样本的平均值进行比较。
平板克隆形成实验将胃癌细胞株常规消化重悬为细胞悬液，密度调整至每毫升250个；
在六孔板中，每孔加入2 mL细胞悬液，每种细胞设置3个平行孔；
放入37℃培养箱中培养10～14天，3～5天更换一次新鲜培养基。每孔加入4%多聚甲醛30 min，用1.0%～1.5%结晶紫染色10～20 min，洗涤晾干后用1 mL无菌水溶解，自动酶标仪在450 nm波长处测定各组的吸光度值，独立实验重复3次。
划痕实验检测细胞迁移能力在六孔板中接种5×105个胃癌细胞。在第二天细胞铺满后，用枪头比着直尺，垂直于平面划除细胞，PBS清洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。将六孔板放入CO2培养箱中，于0、6、12、24、48、72 h在同一位置进行拍照和比较分析。采用ImageJ对同一视野不同时间照片的无细胞区域进行圈套和面积计算。0 h无细胞区域的面积为A cm3，48 h无细胞区域的面积为B cm3，细胞迁移的面积比例为（A-B）/A。
Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力准备Transwell小室，按照每100μL无血清培养基含1×105胃癌细胞接种于上室，下室的培养基加入20%血清，培养6 h后显微镜下计数滤膜下表面的细胞数量，即迁移实验。用铺好100 μL Matrigel的小室重复，即侵袭实验。下室拍照后图片按照水平正中线和垂直正中线分割为4个象限，两名研究者在4个象限中通过放大的图片进行独立的细胞计数，计数一致后，4个象限的细胞数量取平均值。每个对照组和实验组实验重复3次。
RNA提取、反转录及荧光定量qPCR使用Trizol法提取组织及细胞的mRNA，并利用TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT reagent Kit（RR047A）进行。定量qPCR的引物如下：PTPRS的引物（正向：5’-CAAAGAACCCAAGGACCAGAT-3’；
反向：5’-CTCATCAAACTCAATCGTCTCA-3’），PCR产物长度为148 bp，溶解温度为60℃。GAPDH的 引 物（正 向：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’；
反向：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’），PCR产物长度为450 bp，溶解温度为58℃。使用Takara公司的TB Green Fast qPCR Mix（RR430S）试剂盒进行定量qPCR。
Western blot法检测蛋白表达细胞收集后加入RIPA裂解液常规方法提取细胞的总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取30～50 μg蛋白质，行10%～15%SDS-PAGE电泳。电泳完毕后，4℃、100 V转移100 min至0.45 μm PVDF膜 上。PVDF膜 用 含5%～10%脱脂奶粉的TBST室温封闭1 h后，加入一抗4℃孵育过夜，洗膜后加入二抗室温孵育1.5 h，洗膜后加入显色液常规显像。
统计学方法采用Stata 14.0和Prism 6.0统计软件对数据进行统计学分析，所有实验数据均用±s或%表示，两组均数的比较采用t检验，配对资料两组均数比较采用配对t检验，计数变量比较采用χ2检验，生存分析采用Kaplan Meier分析及Cox比例风险回归。P＜0.05为差异有统计学意义。
PTPRS在胃癌中低表达且与不良预后相关我们收集了141例胃癌患者癌组织进行免疫组织化学染色，患者中男性为76.6%，中位年龄为（59.40±10.60）岁。将患者按PTPRS表达水平分为低表达组（图1A）和高表达组（图1B），其中低表达组55例，高表达组86例，结果显示PTPRS低表达与不良分化（P=0.012）及神经浸润（P=0.036）密切相关（表1）。进一步生存分析显示，PTPRS低表达是胃癌患者复发时间（log rankP=0.040，图1C）及生存时间（log rankP=0.009，图1D）缩短的重要预测因素。多因素分析显示校正性别、神经浸润、T分期、N分期、M分期等单因素分析中P＜0.2的危险因素后，PTPRS低表达对预后的影响仍有统计学意义（P=0.021，表2）。对10对胃癌患者的癌组织和癌旁组织进行qPCR检测，配对检验发现癌组织与癌旁组织相比PTPRS表达量显著降低（P=0.011，图1E）。对胃癌细胞系及正常胃黏膜细胞系的qPCR检测显示，与正常胃黏膜细胞系GES-1相比，胃癌细胞系中PTPRS普遍低表达（图1F）。选取表达量相对较高且体内成瘤性较强的SGC7901及HGC27两种细胞系进行进一步功能实验。
表1 PTPRS不同表达水平胃癌患者临床病理因素差异Tab 1 Clinicopathological characteristics of gastric cancer patients in different PTPRS expression subgroups［n（%）］
表2 胃癌患者总生存时间的单因素及多因素分析Tab 2 Univariate and multivariate analysis of factors associated with overall survival in gastric cancer patients
图1 PTPRS在胃癌中低表达且与不良预后相关Fig 1 PTPRS is low expressed in gastric cancer and is closely related to poor prognosis
PTPRS低表达促进胃癌增殖在SGC7901及HGC27两种细胞系中用慢病毒转染构建PTPRS干扰的稳转株，qPCR验证干扰效率（图2A，2B）。CCK-8实验发现，PTPRS低表达显著促进胃癌细胞的生长速度（图2C，2D），与HGC27 GFP组和SGC7901 GFP组 相 比，HGC27PTPRSsh和SGC7901PTPRSsh组的细胞生长速度明显增加（HGC27组：Pd1=0.012，Pd2=0.008，Pd3=0.003，Pd4=0.003，Pd5=0.026；
SGC7901组：Pd1＜0.001，Pd2=0.005，Pd3＜0.001，Pd4＜0.001，Pd5＜0.001）；
克隆形成实验表明，HGC27PTPRSsh和SGC7901PTPRSsh组形成的克隆数明显多于HGC27 GFP组和SGC7901 GFP组（图2E，2F），差异有统计学意义（P均＜0.001）。提示PTPRS低表达促进胃癌细胞增殖。
图2 PTPRS低表达促进胃癌细胞增殖Fig 2 Low expression of PTPRS promoted proliferation of gastric cancer cells
PTPRS低表达促进胃癌细胞迁移侵袭在PTPRS干扰的稳转株中，划痕实验表明，与HGC27 GFP组、SGC7901 GFP组相比，HGC27PTPRSsh和SGC7901PTPRSsh组的细胞划痕修复能力明显增强（图3A，3B），差异有统计学意义（HGC27组：P=0.002；
SGC7901组：P=0.022）。Transwell迁 移实验表明，与HGC27 GFP组和SGC7901 GFP组相比，HGC27PTPRSsh组和SGC7901PTPRSsh组胃癌细胞迁移到下层小室的数目明显增加（图3C、3D；
HGC27组：P=0.012；
SGC7901组：P＜0.001）。Transwell侵袭实验中结果相似，HGC27PTPRSsh组和PTPRSsh组胃癌细胞迁移到下层小室的数目明显多于HGC27 GFP组和SGC7901 GFP组（图3C、3D；
HGC27组：P=0.004；
SGC7901组：P=0.008），表明PTPRS低表达促进胃癌细胞迁移侵袭。
图3 PTPRS低表达促进胃癌细胞迁移侵袭Fig 3 Low expression of PTPRS promoted migration and invasion of gastric cancer cells
PTPRS低表达对EMT的影响观察HGC 27和SGC 7901两种细胞干扰PTPRS后细胞形态的变化，发现PTPRS干扰后细胞出现轻微的梭形改变（图4A），在HGC 27细胞中更加明显。对于PTPRS干扰的胃癌细胞系进行EMT相关蛋白的检测，发现PTPRS干扰后细胞N-cad、ASMA表达增加，但E-cad变化不明显。Slug有增加趋势，Snail及Vimentin变化不明显（图4B）。提示PTPRS低表达可能通过促进EMT从而促进胃癌细胞迁移侵袭。
图4 PTPRS干扰对胃癌细胞系中EMT的影响Fig 4 Effect of PTPRS interference on gastric cancer cell lines
蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）和蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTP）的生物学功能是催化ATP的γ磷酸基转移到蛋白质的酪氨酸残基上，或催化蛋白质的酪氨酸残基上的磷酸基团转移到ATP上，从而决定蛋白质的活化与否，影响生物学行为［4］。PTK在肿瘤发生发展中的作用重要、机制清晰，多个针对PTK的单克隆抗体和小分子抑制剂已经应用于临床［8］。PTP的发现虽然比PTK滞后，但近年来随着研究不断深入，多种PTP家族成员的在肿瘤中的功能得到证实，下游机制也逐渐清晰。例如PTPRT启动子区域的高甲基化抑制PTPRT表达，异常激活下游STAT3通路，是非小细胞肺癌靶向治疗耐药的关键机制［9］。非受体型酪氨酸磷酸酶3（protein tyrosine phosphatase non receptor 3，PTPN3）的激活性突变是肝内胆管细胞癌持续增殖和侵袭转移的关键致病基因［10-11］。随着对PTP的生物学功能和作用机制的研究逐渐深入，PTP成为继PTK之后重要的肿瘤靶向治疗开发位点［12］。PTPRS参与神经系统发育，并在免疫调节、细胞自噬等过程中发挥重要作用，在肿瘤中的作用也受到越来越多的关注，24%的头颈肿瘤患者PTPRS缺失，是其靶向治疗耐药的关键因素之一［13］。PTPRS调控ERK的异常激活及其核质分布失衡对结直肠癌的增殖起到重要的促进作用［14］。78%的肝细胞肝癌中PTPRS的表达水平降低，且PTPRS的低表达与肝癌的恶性临床表型显著相关，是肝癌患者生存和复发的独立危险因素［15］。
相关报道均提示PTPRS可能起到抑制肿瘤发展的作用，但在胃癌中的作用未见报道。为了探索PTPRS在胃癌中的作用，我们首先分析了PTPRS胃癌患者样本中的表达情况，发现PTPRS低表达与不良分化及神经浸润密切相关，进一步生存分析显示PTPRS低表达是胃癌患者生存时间缩短的独立危险因素。继而对10对胃癌患者的癌组织和癌旁组织进行配qPCR检测，发现癌组织与癌旁组织相比PTPRS表达量显著降低。这些结果提示PTPRS在胃癌中可能也起到抑癌基因的作用。
在SGC7901及HGC27两种细胞系中用慢病毒转染构建PTPRS表达干扰的稳转株，qPCR验证干扰效率。CCK-8实验发现，PTPRS低表达显著促进胃癌细胞的生长，克隆形成实验表明PTPRS低表达显著促进胃癌细胞克隆形成能力，划痕实验和Transwell实验表明PTPRS低表达显著促进胃癌细胞迁移和侵袭能力。我们的体外实验结果基本与标本检测结果中预测的结果相符。
上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是指上皮细胞转变获得间质细胞表型的生物学过程，在肿瘤发生中发挥关键作用［16］。我们对于PTPRS干扰的胃癌细胞系进行EMT相关蛋白的检测，发现PTPRS干扰后细胞出现N-cad、ASMA表达增加等表现，提示PTPRS低表达可能通过EMT促进胃癌迁移侵袭。既往在肝癌中发现PTPRS低表达通过EGFR/PI3K/mTOR通路介导EMT［14］，而上皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）是介导的EMT过程的关键分子。近期在恶性外周神经鞘瘤中发现PTPRS低表达通过上调profilin-1从而激活EMT［17］。在头颈癌中和肝癌中有报道PTPRS低表达通过靶向STAT3促进肿瘤进展［18-19］。而在结直肠癌中PTPRS可以抑制Erk及其核转位［20］。由此可见，PTPRS在不同肿瘤中发挥作用所靶向的下游底物存在显著的异质性，在胃癌中PTPRS发挥抑癌作用的可能通路及潜在下游底物目前仍没有报道，其具体机制有待进一步的研究。
本研究存在以下不足：第一，由于PTPRS蛋白编码序列过大（相对分子质量为220 000），超过了慢病毒载体的可包装大小，无法构建过表达的高效慢病毒载体和细胞模型。质粒转染效率也因质粒过大，转染效率不高，因而没有进一步开展PTPRS过表达的相关功能实验及机制探究。为了弥补这一不足，在PTPRS干扰模型中，我们利用两株来源不同的胃癌细胞系进行功能实验和机制探究。第二，PTPRS对胃癌的影响仍需进一步在体内模型中进行验证。第三，对于PTPRS在胃癌中发挥生物学作用的具体机制仍需进一步阐明。
综上所述，PTPRS低表达能够增强胃癌细胞增殖、迁移和侵袭形成能力，有可能与激活EMT相关，提示PTPRS有可能成为胃癌的潜在治疗靶点，但其功能、分子机制和信号转导通路尚待深入研究。
作者贡献声明刘歆阳研究设计，数据整理，统计分析，论文撰写。何梦江数据整理，论文构思。陈巍峰论文修订。李全林，周平红研究设计和指导，论文修订和审阅。
利益冲突声明所有作者均声明不存在利益冲突。
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