非小细胞肺癌中TLR4、Ki-67,和Caspase-3,的表达研究

龚长银，马建荣，陆海舟

(江苏省南通市中医院，南京中医药大学南通附属医院病理科，南通 226001)

在世界范围内，肺癌是最常见的恶性肿瘤和癌症相关死亡原因[1]。其中80%的肺癌病例是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)[2]。尽管肺癌的诊治手段不断进步，但其5 年生存率仅约15%。NSCLC 机制复杂，其发生、发展涉及多基因的异常，是一个多阶段演变的过程。研究[3]发现，15%～20%的肿瘤与慢性感染和炎症相关，肺部慢性炎症性疾病是促进肺癌发生发展的重要后天因素。近年来发现的Toll 样受体(Toll-like receptors,TLRs)是一组新的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)，可通过先天免疫和炎症反应机制监测感染并对其做出反应，其中TLR4 是第1 个被鉴定的TLRs，除免疫细胞外，多种肿瘤细胞也表达TLR4，TLR4 信号通路可促进炎症反应、促进肿瘤细胞增殖和抗凋亡，从而在肿瘤的发生、发展和肿瘤转移中发挥重要作用[4-6]。作为增殖细胞核抗原的Ki-67，存在于细胞周期G0以外的各期细胞，常作为细胞增殖评价指标同与细胞凋亡密切相关的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Caspase-3)应用于多种恶性肿瘤的研究[7-12]。因此，本研究拟通过免疫组织化学方法观察TLR4、Ki-67 和Caspase-3 蛋白在NSCLC 与正常肺组织中的表达情况及其与临床病理特征之间的关系。

1.1 材料来源

1.1.1 临床标本及病理资料 收集南通市中医院2012—2016 年间住院患者手术切除标本51 例，均经病理证实为NSCLC，对照样本为经病理证实的正常肺组织(距离癌组织边缘＞5 cm)。年龄40～83 岁，中位年龄67 岁。术后病理参考《肿瘤组织病理学诊断》第3 版进行命名及分类。本研究经患者知情同意，并获得南通市中医院伦理委员会批准(通中院[2021]字003)。

1.1.2 主要试剂 兔抗TLR4 抗体(Santa Cruz，1∶100)，兔抗Caspase-3 抗 体(Cell Signaling，1 ∶300)，兔抗Ki-67 抗体(即用型)、UltraSensitiveTMSP 超敏试剂盒(鼠/兔)、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered,PBS)、柠檬酸盐抗原修复液、二氨基联苯胺显色试剂盒(福州迈新)。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学 SP 法，石蜡切片脱蜡水化后，PBS 冲洗3 次，3 min/次；
根据一抗要求，进行相应的抗原修复；
每张切片加50 μL 过氧化物酶阻断溶液，室温孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性，PBS 冲洗3 次，3 min/次；
除去PBS 液，每张切片加50 μL 正常非免疫动物血清，室温孵育10 min；
一抗，4 ℃过夜，PBS 洗3 次；
加生物素标记的二抗，室温孵育10 min，PBS 洗3 次；
加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温孵育10 min，PBS 洗3 次；
二氨基联苯胺显色，显微镜下观察3～10 min；
自来水冲洗，苏木精复染，自来水冲洗返蓝；
经梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。同时做阳性、阴性对照。

1.2.2 结果判定 在NSCLC 和正常肺组织中，TLR4 以细胞质和(或)细胞膜呈棕黄色或棕褐色为阳性，Ki-67 以细胞核出现棕黄色或棕褐色为阳性，Caspase-3 以细胞质内出现棕黄色或棕褐色为阳性。观察阳性细胞采用染色强度+染色细胞百分率综合计分方式评估染色结果。染色强度(以多数细胞为准)：无阳性细胞为0 分，淡黄色为1 分，黄色为2 分，棕黄色为3 分，褐色为4 分。染色细胞百分率按照在观察的高倍视野中，计数100 个细胞中阳性细胞所占百分比评分：无阳性细胞为0 分，阳性细胞≤25%为1 分，＞25%～50%为2 分，＞50%～75%为3 分，＞75%为4 分。总分标准为：0 分为-，1～4 分为+，5～8 分为++。+为弱阳性，++为强阳性，弱阳性归为阴性表达，强阳性归为阳性表达[13]。

1.2.3 统计学方法 数据采用SPSS 26.0 软件处理。计数资料采用χ2检验或Fisher 确切概率法；
采用Spearman 分析观察指标之间的相关性，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.1 TLR4、Ki-67 和Caspase-3 蛋白在NSCLC 组织和正常肺组织中的表达 NSCLC 组织中TLR4 和Ki-67 蛋白的阳性表达率[66.67%(34/51)、68.63%(35/51)]显著高于正常肺组织[37.25%(19/51)、5.88%(3/51)](χ2=8.837、42.947,P=0.003、P＜0.01)；
Caspase-3在NSCLC 组织中的阳性表达率[54.90%(28/51)]低于正常肺组织[78.43%(40/51)](χ2=6.353,P=0.012)。TLR4、Ki-67 和Caspase-3 在NSCLC 不同组织学类型及正常肺组织中的阳性表达典型图见图1。

图1 TLR4、Ki-67 和Caspase-3 在NSCLC 组织中的表达(400×)

2.2 TLR4、Ki-67和Caspase-3蛋白的表达与NSCLC 患者临床病理特征的关系 TLR4 蛋白在中、高分化NSCLC 中的阳性表达率差异有统计学意义(P＜0.05)；
而在不同性别、年龄、肿块和组织学类型及有无淋巴结转移NSCLC 中的表达差异均无统计学意义(均P＞0.05)。Ki-67 蛋白在中、低分化NSCLC 组织中的阳性表达率较高分化明显增高(P＜0.01)；
而在不同性别、年龄、肿块和组织学类型及有无淋巴结转移的NSCLC 中的表达差异均无统计学意义(均P＞0.05)。Caspase-3 蛋白在鳞癌、淋巴结阳性患者中的阳性表达率分别较腺癌、淋巴结阴性患者高(均P＜0.05)；
而在不同性别、年龄、肿块类型和分化程度患者中的阳性表达率差异无统计学意义(P＞0.05)(表1)。

表1 TLR4、Ki-67 和Caspase-3 在NSCLC 中的表达及与临床病理特征的关系(n,%)

2.3 NSCLC 组织中TLR4 和Ki-67 表达的相关性在NSCLC 组织中，Ki-67 和TLR4 均阳性表达29例，均阴性表达11 例，Ki-67 阳性而TLR4 阴性表达6例，Ki-67阴性而TLR4阳性表达5例。通过Spearman 等级相关分析得出rs=0.420，两者之间呈正相关(P=0.002)，见图2A。

2.4 NSCLC 组织中Ki-67 和Caspase-3 表达的相关性 在NSCLC 组织中，Ki-67 和Caspase-3 均阳性表达16 例，均阴性表达4 例，Caspase-3 阳性而Ki-67 阴性表达12 例，Caspase-3 阴性而Ki-67 阳性表达19 例。通过Spearman 等级相关分析得出rs=-0.102，无统计学意义(P=0.478)，见图2B。

2.5 NSCLC 组织中TLR4 和Caspase-3 表达的相关性 在NSCLC 组织中，TLR4 和Caspase-3 均阳性表达17 例，均阴性表达6 例，Caspase-3 阳性而TLR4 阴性表达11 例，Caspase-3 阴性而TLR4 阳性17 例，通过Spearman 等级相关分析得出rs=0.044，无统计学意义(P=0.761)，见图2C。

图2 NSCLC 组织中TLR4、Ki-67 和Caspase-3 表达水平相关性的散点图

TLRs 为一类非特异性的单次跨膜糖蛋白受体家族，分为胞内区、胞外区和跨膜区[14]，本研究TLR4阳性表达定位于胞膜和(或)胞质。TLR4 是与炎症、肿瘤关系最为密切的TLRs 家族成员之一[15-17]。研究[17-18]表明，TLR4 表达在多种肿瘤细胞表面，如乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌和肺癌细胞等，并有一定的预后意义。最近研究[19]发现，TLR4 在乳腺癌组织中过表达，并与淋巴结转移和病理分级呈正相关。本研究发现，TLR4 蛋白在NSCLC 组织中的阳性表达率显著高于正常肺组织，提示TLR4 可能通过某种分子通路参与并促进NSCLC 的发生和发展，与H.Y.FU等[20-21]研究结果一致，本研究中TLR4 蛋白在有或无淋巴结转移的NSCLC 组织中表达差异无统计学意义。

促进恶性肿瘤进展的重要因素也涉及细胞的过度增殖及凋亡障碍，而Ki-67 是与DNA 合成关系非常密切的细胞核增殖抗原之一，表达于G1、S、G2和有丝分裂期细胞，而在G0期细胞不表达，是评价细胞增殖活性有用的标志物，且广泛应用于肿瘤的治疗和研究中[7]。Ki-67 的高表达有助于肺、宫颈和喉鳞癌的侵袭性和浸润性生长[8-10]。研究[11,22-24]发现，胃癌和乳腺癌中Ki-67 的过表达与淋巴结转移呈正相关，Ki-67 的高表达与肺癌、前列腺癌、膀胱癌和乳腺癌等的不良预后有关。本研究结果显示，Ki-67 阳性表达定位于细胞核，在NSCLC 组织中的阳性表达率显著高于正常肺组织，且与肿瘤分化程度有关。中分化和低分化NSCLC 患者肿瘤组织中Ki-67 阳性率明显高于高分化肿瘤组织。

含半胱氨酸的Caspase 是一组与真核细胞凋亡密切相关的酶，参与细胞的生长、分化和凋亡调节，其中Caspase-3 是凋亡级联反应的最终效应蛋白酶，参与凋亡过程中重要底物的剪切而导致细胞凋亡[25]。Caspase-3 的异常表达和(或)活化参与多种类型肿瘤的发生发展，与分化良好的前列腺癌和正常组织比较，在中分化和低分化的前列腺癌标本中观察到Caspase-3 表达降低[26]。此外，Caspase-3 的高表达与乳腺癌的不良预后显著相关[12]。本研究结果显示，Caspase-3 在NSCLC 组织中的阳性表达率显著低于正常肺组织，且与组织学类型和淋巴结转移状态有关。鳞癌和淋巴结阳性患者肿瘤组织中Caspase-3 阳性率明显高于腺癌和淋巴结阴性患者的肿瘤组织。

综上所述，NSCLC 组织中TLR4、Ki-67 表达上调和Caspase-3 表达下调，TLR4 和Ki-67 的表达与肿瘤分化程度有关，肿瘤分化越低，TLR4 和Ki-67表达越强，且两者之间呈正相关。而TLR4、Ki-67 与Caspase-3 间未发现相关性。因此，需结合多个检测指标才能在判断NSCLC 恶性程度和预测预后中具有更重要的指导意义。

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