外泌体标志物及临床应用研究*

李伟，吴佩佩，钱晖，许文荣

(江苏大学医学院，江苏镇江 212013)

外泌体(exosome)是一类直径约为30～150 nm、起源于内体的脂质双层囊泡，几乎来源于所有类型细胞中，并在体液(包括唾液、尿液、血液和母乳等)中大量存在。外泌体所包含的蛋白质/脂质和核酸等内容物是一种新的细胞间通讯分子，外泌体转运的生物活性分子主要通过以下机制影响靶细胞：通过表面结合的配体直接激活靶细胞；
将活化的受体转移至受体细胞；
通过功能蛋白、脂质和RNA的传递对受体细胞进行表观遗传重编程。另外在免疫系统中，外泌体还可参与抗原呈递、免疫激活、免疫抑制以及通过外泌体介导的细胞间通迅产生的免疫耐受性等免疫调节作用。由于外泌体与多种疾病的发生进展密切相关，外泌体相关的分子标志物检测在疾病的诊断及疗效评估中优势突出。本文旨在对外泌体标志物及其在临床中的应用研究进行简要评述。

外泌体在调控肿瘤细胞的基因突变、无限增殖、血管生成、转移和免疫逃逸等方面起着重要的作用[1]。外泌体在多种体液中的存在和稳定性使其可以作为一种理想的可用于疾病诊断的非创伤性液体活检指标。循环体液中外泌体携带的与癌症相关的生物信号分子或将成为癌症早期检测和治疗的新靶标。

微小RNA(microRNA, miRNA)是非编码RNA(non-coding RNA)中最为常见的一类非编码单链RNA分子，长度约为19～24个核苷酸。研究显示，miRNA是肿瘤外泌体检测中较为常见的标志物，如血液循环中表达升高的外泌体miR-21被证实与多种肿瘤相关，包括胰腺癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌及食管癌等[2]。肿瘤细胞来源外泌体miR-21的高表达可能与其参与的肿瘤血管生成有关。Liu等[3]发现肺癌细胞释放的外泌体miR-21可通过转录信号转导子与激活子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)依赖机制，诱导周围支气管细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的产生，从而促进血管生成。Tanaka等[4]研究发现，食管癌患者血清外泌体miR-21水平显著高于对照组(P=0.000 9)，其进一步以miR-21中位数水平作为截断值，结果发现，miR-21高表达患者与低表达患者病灶转移的比例差异亦有统计学意义(30.8% vs 12%，P=0.041)，提示外泌体miR-21不仅具有作为食管癌的诊断潜力，也可以用于判断疾病发展程度。除了血液外泌体分析外，尿液外泌体标志物分析也可以用于临床诊断，如Armstrong等[5]发现在膀胱癌患者中，尿液miR-21(r=0.88,P<0.001)和miR-4454(r=0.83,P<0.001)的表达水平显著上调，且证实尿液和肿瘤细胞miRNA的表达水平呈正相关(r=0.42,P<0.001)，提示膀胱癌患者尿液的外泌体具有一定的肿瘤特异性，具有良好的临床诊断价值。

外泌体蛋白也可作为肿瘤的诊断标志物。如Chen等[6]采用无标记定量蛋白质组学技术分析乳腺癌患者和健康人对照血浆外泌体，结果发现144种磷蛋白的表达水平显著升高(FDR<0.05)。提示特定外泌体磷蛋白具有肿瘤特异性，具有作为肿瘤诊断生物学标志物的潜力，但外泌体磷蛋白检测的进一步临床应用需要依赖于更多磷蛋白抗体的开发。作为最为重要的肿瘤相关蛋白质之一，凋亡抑制蛋白(survivin)也可作为肿瘤诊断标志物应用于临床。Gleichenhagen等[7]采用ELISA法和商业化试剂盒UBC®Rapid联合检测膀胱癌患者尿液survivin蛋白的表达，结果发现其筛查膀胱癌和健康人对照的ROC曲线下面积(AUCROC)值为0.84，敏感性和特异性分别为66%和95%；
筛查高级别膀胱癌和健康人对照的AUCROC值为0.91，敏感性可提升至82%。但survivin的分泌也可能与炎症发生相关，如何排除炎症干扰是survivin用于膀胱癌诊断需要考虑的一个重要因素。目前已报道的可用于临床诊断的其他外泌体蛋白包括用于肺癌诊断的脂多糖结合蛋白(LBP)[8]、纤维连接蛋白(FN)[9]，用于乳腺癌诊断的重组人SH3-结构域GRB2样2蛋白(SH3GL2)、线粒体融合蛋白2(MFN2)[10]和用于胃癌诊断的三结构域蛋白3(TRIM3)[11]等。

外泌体已被证实与多种神经退行性疾病的发展相关，包括阿尔茨海默病(AD)。Fiandaca等[12]检测57例AD患者和57例健康人对照血液外泌体蛋白的水平差异，发现AD患者总tau蛋白含量(191±12.3 pg/mL,P<0.001)、P-T181-tau(106±6.1 pg/mL,P<0.000 1)、P-S396-tau(25.4±2.25 pg/mL,P<0.000 1)和Aβ1-42(18.5±2.97 pg/mL,P<0.000 1)均显著高于健康人对照(分别为130±11.9 pg/mL,16.9±1.89 pg/mL,3.88±0.26 pg/mL和0.83±0.13 pg/mL)。进一步分析发现，AD患者确诊时的血清P-T181-tau和P-S396-tau水平与AD患病前(1～10年)相比差异无统计学意义，但Aβ1-42水平却显著升高，表明Aβ1-42或可提前1～10年预判AD的发生。

外泌体的miRNA在AD的诊断上也具有一定的应用价值。Lugli等[13]等发现AD患者血浆外泌体中miR-342-3p(340.63 vs 547.94,t=0.003 9,P<0.05)和miR-23b-3p(285.73 vs 378.79,t=0.022 8,P<0.05)水平均与健康对照人群存在显著性差异，提示血浆外泌体miR-342-3p和miR-23b-3p的显著下调具有诊断AD的潜力。在脑脊液外泌体标志物中，Riancho等[14]发现在18例AD患者和18例对照组脑脊液样本中，miR-9-5p和miR-598在AD患者中的检出率均为0%，而在对照组中的检出率分别为50%(P=0.001)和75%(P<0.001)。提示脑脊液外泌体miRNA在AD诊断中具有潜在的临床价值，但脑脊液取样需要进行局部麻醉后行腰椎穿刺，采样便捷性要低于血样采集。

Raoof等[15]通过一项大样本量的回顾性研究，发现血浆外泌体miR-27a-3p、miR-328-3p和miR-654-3p筛查遗传性全面性癫痫(genetic generalized epilepsies，GGE)的AUCROC值分别为0.73,0.72和0.63，而三者联合检测可以提高至0.74。提示miR-27a-3p、miR-328-3p和miR-654-3p联合检测可以作为GGE筛查的潜在标志物。此外，Martins-Ferreira等[16]发现miR-146a、miR-155和miR-132可能参与了GGE的病理过程，尤其是miR-155在癫痫患者体内显著升高(P<0.001)，可作为判断癫痫进展的重要指标。随着研究的进一步深入，外泌体标志物在癫痫的诊断方面有望得到进一步应用。

在病毒和细菌感染的过程中，微生物以及被感染细胞均能产生外泌体，这些外泌体在炎症反应、免疫调节、扩散感染、宿主细胞死亡、病原体清除及疾病诊断等方面发挥着重要的作用。因此，外泌体具有成为多种感染性疾病诊断生物学标志物的潜力。

外泌体参与HBV感染的多个步骤并调控感染后的免疫反应，某些外泌体miRNAs有望成为判断肝组织炎症的敏感生物学标志物。例如，李荣华等[17]证实在持续丙氨酸氨基转移酶(ALT)正常的HBV患者中，肝组织炎症分级≥A2和而6种mirna显著下调，其中hsa-mir-372-3p、hsa-mir-374c-3p和hsa-mir-5585-3p相比对照组的log2值分别为-9.610 7、-7.522 5和-7.175 2。表明外泌体mirna检测在持续alt水平正常的肝病患者上具有较高的敏感性，可能用于肝组织炎症的分级判断。另外，wang等[18]研究表明，肝癌患者血清外泌体中mir-21明显高于慢性肝炎患者或健康人对照(分别高2.21倍和5.57倍,p<0.000 1)，可用于肝癌患者和慢性肝炎患者的鉴别诊断。慢性肝炎向肝癌的转变过程中，mir-221、let-7a、mir-191、mir-26a和mir-181a的联合检测可用于肝病的疾病进展和肝癌的早期诊断[19]。< p>

外泌体标志物在结核病的诊断方面也有一定的进展。Diaz等[20]发现，结核分枝杆菌(Mtb)感染可导致外泌体蛋白质组分发生显著变化，其中有41种蛋白质显著富集，包括热休克蛋白90(HSP90), 波形蛋白(vimentin), 冠蛋白1C (coronin 1C)和膜突蛋白(moesin)等，并与膜蛋白呈显著相关。Lin等[21]分别对肺炎、肺结核和肺癌患者胸腔积液外泌体的miRNA进行检测，发现miR-378i在肺结核患者中的表达水平显著升高(P<0.01)，提示miR-378i在肺结核诊断中具有较高的应用潜力。

心血管系统的多种细胞均可产生外泌体，外泌体介导的信号传导、炎症反应与凝血等生物学功能在心血管系统的病理生理过程中具有重要的作用。内皮细胞凋亡、炎症及缺氧状态下均可增加外泌体的释放，释放的外泌体与促炎、促凝血因子及血栓形成有关，参与了动脉粥样硬化的发生、发展[22]。Wang等[23]检测了65例动脉粥样硬化患者和68例健康人对照的血浆外泌体中长链非编码(LncRNA)低氧诱导因子1α反义链(HIF1 α-antisense RNA1，HIF1A-AS1)的表达差异，发现患者血浆中HIF1A-AS1显著高于对照组(P<0.01)，HIF1A-AS1的表达与循环外泌体水平呈显著相关性(r=0.875,P<0.001)，ROC曲线分析证实，血浆外泌体和HIF1A-AS1区分动脉粥样硬化和健康人对照的AUCROC值分别为0.861和0.823，提示循环外泌体和HIF1A-AS1检测具有动脉粥样硬化的诊断潜力。

Jansen等[24]分析了181例冠心病患者的外泌体miRNA水平，发现外泌体中高表达miR-126和miR-199-a的患者可以降低心血管事件的发生率，其风险比(OR)分别为0.485和0.518(P<0.05)，进一步行Kaplan-Meier生存分析，结果显示高表达miR-126的患者与低表达患者相比，首次心血管事件(major adverse cardiovascular event, MACE)的发生率显著下降(P=0.007),miR-126高表达和低表达患者无MACE发生的8年生存率分别为79.5%和60.2%。提示外泌体miR-126和miR-199-a可以用于预判冠心病患者心血管事件的发生风险。

除了在上述疾病中的诊断应用外，外泌体作为诊断标志物也在其他类型的疾病上进行了大量的研究。例如在自身免疫性疾病方面，Song等[25]发现类风湿关节炎(RA)患者体内外周血单个核细胞来源的外泌体HOX转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA, hotair)水平明显高于健康人对照，平均升高约4倍(1.6～6.5倍，P<0.001)。Zhang等[26]发现RA患者和健康人对照滑膜细胞外泌体中LncRNAs存在差异表达，其中LncRNA ENST00000483588上调，而LncRNA ENST00000438399、LncRNA uc004afb.1、LncRNA ENST00000452247下调，其筛查RA和健康人对照的AUCROC分别为0.85、0.92、0.97和0.92。提示这些LnRNAs的失调可能参与RA的病变过程。在系统性红斑狼疮方面，Perez-Hernandez等[27]发现与健康人对照相比，系统性红斑狼疮(SLE)患者尿液外泌体miR-146a的表达水平显著上升(1 vs 15，P<0.01)。另外miR-146a鉴别诊断合并活跃期狼疮肾炎SLE患者和无狼疮肾炎SLE患者的AUCROC为0.960，当cut-off值为15.3时，其敏感性为100%，特异性90%。提示尿液miR-146a水平可以作为SLE的疾病标志物，同时也具有判定SLE进展程度的潜力。

6.1蛋白质检测 经典的蛋白质分析方法主要包括ELISA法和western blot，但二者并不适合于外泌体蛋白的检测，目前检测方法主要基于抗体、核酸适配体和蛋白质组学相关质谱技术。随着适配体技术的发展，需要复杂检测准备流程的抗体检测的缺点越来越凸显。蛋白质组学相关质谱因其庞大的数据量以及操作的复杂程度也不适合于将来应用于快速临床检测的需求。适配体检测方法结合了成熟的核酸技术，其作用本质是一段单链DNA或者RNA分子折叠形成特定三维结构，并与生物靶标高亲和力和高特异性结合。核酸适配体同时具有特异性识别能力和基于PCR/HCR(杂交链式反应)的信号放大能力。相对于抗体而言核酸适配体的结合能力较低，有利于外泌体的洗脱，从而可以避免造成对外泌体形态学和功能分析的影响[28]。因此核酸适配体在外泌体的检测中将起到越来越重要的作用。

6.2核酸检测 RNA是外泌体中起到关键作用的装载物，而DNA的含量则相对较少[28]。外泌体纯化后，可以采用多种商业化试剂盒进行RNA的提取和纯化。RNA的定量分析可以采用分光光度计通过芯片和软件操作进行分析。RNA的表达分析则可以通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)或基因芯片(microarray)进行。对于极微量核酸样本的检测以及拷贝数变异状态的分析，可以使用微滴式数字 PCR (droplet digital PCR，ddPCR)进行分析，其灵敏度和精确度均高于 qPCR。二代测序技术(next-generation sequencing)可以分析外泌体中的全转录组，有助于发现新的有效序列。大多数RNA的检测方法也可用于外泌体DNA的检测。

6.3脂质体检测 细胞水平脂质体的分析已有相对成熟的方法，但由于外泌体中脂质体的功能有限，近年来关于脂质体检测方法创新的报道少见[28]。已有方法包括薄层色谱法(TLC)、液相色谱法(LC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、电喷雾电离质谱法(ESI-MS)、气相色谱电子轰击质谱法(GC-EI-MS)、液相色谱电喷雾电离串联质谱法(LC-ESI-MS/MS)等。

在外泌体的检测未来发展上，微流控技术也是一个可能的方向。微流控技术只需要较小的样本量，可以大大减少检测的规模和成本以及操作的复杂度，能够在较小的空间内同时实现多个样本的快速检测。通过实现微流控芯片的免疫捕捉功能，可以将微流控芯片和免疫磁珠两者的优势结合起来[29]。磁珠-外泌体结合体可以结合一些表征分析技术，比如流式细胞术、电镜等，从而实现在分离过程中同时检测，节约检测时间。

生物传感平台，包括基于表面等离子共振技术(surface plasmon resonance technology, SPR)和表面增强拉曼散射(Surface-Enhanced Raman Scattering，SERS)的生物传感器技术也有报道应用于外泌体的检测。Fan等[30]建立了 SPR成像生物传感平台，该平台具有3个分别用不同抗体(CD63，EGFR 和 EpCAM)修饰的通道，可用于非小细胞肺癌(NSCLC)衍生的不同亚型的外泌体检测。Zhang等[31]报道了一种快速灵敏的SERS生物传感器，同时可以检测外泌体上的多种蛋白质标记并进一步进行表型分析。

外泌体作为细胞间信号转导的基本方式之一，携带有蛋白质、核酸、脂质等大量生物活性物质，且具有稳定性好、内容物丰富、无创及检测迅速的优势，已经在肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病等多种疾病的诊断和预后判断中显示出巨大的潜力[32]。但目前很多经过初步研究发现的具有诊断潜力的外泌体标志物仍缺乏大样本量重复性验证的临床确认过程，在临床上的广泛应用受到一定的限制。不同体液中的外泌体分离提取方法包括采集、预处理和保存等均影响检测结果，因此获取稳定均一、易于标准化的体液外泌体提取方法是本领域重要挑战之一。随着不同类型疾病发生、发展过程中外泌体参与机制的深入研究，高通量筛选技术的发展，以及针对不同疾病类型标本采集方式的规范，外泌体标志物将有望进入广泛的临床应用阶段。

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