莫佳佳 赵炎 周鹏 储昭兴 邵莉 王翔
【摘要】目的：探讨甘草苷对大鼠心梗后心室重构的保护作用及机制。方法：采用左冠脉结扎术制备大鼠心梗模型，造模24h后将成模的大鼠随机分为模型组、甘草苷（25、50、100 mg/kg）组、卡托普利（2.5 mg/kg）组，另设假手术组，连续灌胃给药28 d。末次给药后，采用PowerLab数据采集分析系统检测血流动力学指标及测量心脏重量指数（HWI），HE及天狼星红染色观察大鼠心肌组织病理学变化，TUNEL染色观察大鼠心肌组织中细胞凋亡情况，免疫荧光法检测大鼠心肌组织 CXCR2的表达，Western blot法检测大鼠心肌组织 CXCR2、NF-κB p65、p-NF-κB p65的表达，ELISA法检测心肌组织中IL-1β、IL-17水平。结果：甘草苷较模型组能够显著提高模型大鼠左心室收缩压（LVSP）、左心室压力最大收缩率（+dp/dtmax）、左心室压力最大舒张率（-dp/dtmax），降低左心室舒张末期压（LVEDP）和大鼠心脏HWI（P<0.05，P<0.01），且作用呈现剂量依赖性。LIQ最佳剂量100mg/kg下进一步研究，结果可见LIQ能够明显改善心肌病理改变，减轻心肌间质胶原的过度沉积，抑制心肌细胞凋亡（P<0.01），减少CXCR2、p-NF-κB p65蛋白表达（P<0.01），以及下调炎症因子IL-1β、IL-17含量（P<0.01）。结论：甘草苷对大鼠心梗后心室重构具有明显的保护作用，其机制可能与调控CXCR2/NF-κB信号轴，减少炎性因子释放，发挥抗炎作用有关。
【关键词】甘草苷;大鼠;后心室重构;保护作用;潜在机制
【中图分类号】S567.7+1【文献标识码】A【文章编号】2026-5328（2022）04--02
急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）简称心梗，是当前全球范围内心衰发生最常见及最重要的病因之一[1]。心梗后，心脏的结构与功能常被“心室重构（ventricular remodeling，VR）”这一病理生理过程调控，表现为心肌细胞、非心肌细胞的凋亡、肥大与表型改变以及细胞外基质平衡的破坏。VR的病理机制受多种因素的影响，在这些因素中，炎症反应起着关键作用。当心梗后病灶部位能够不断的产生免疫细胞趋化因子，招募循环系统的免疫细胞进入梗塞心肌区域，产生致炎因子不断损伤心肌组织，甚至周围组织，加剧炎症破坏[2]。CXC受体2（CXCR）为多种免疫细胞的趋化因子受体，与包括心力衰竭在内众多心血管疾病的发生发展密切相关，通过CXCR2敲除或使用选择性CXCR2抑制剂能够减弱Ang II 诱导的小鼠心脏重塑和炎症反应，而NF-κB为多向调节的转录因子，可受CXCR2的调控，在炎症反应的调控中处于核心地位，参与心衰的发生发展过程。甘草苷（Liquiritin，LIQ）为甘草的活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等药理作用，研究表明，LIQ可以通过抑制炎症细胞迁移，减轻心肌纤维化，减轻心肌损伤等发挥心脏保护作用。然而LIQ是否能抑制大鼠心梗后心室重构，其抑制心室重构的作用是否与减轻炎症反应有关尚未明确。因此，本研究旨在探讨LIQ对大鼠心梗后心室重构的作用及在心室重构过程中对CXCR2参与的炎症轴的影响，以期为其临床应用提供理论依据。
1.实验材料
1.1试验动物
SPF 级雄性SD 大鼠，体质量200-250 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司（动物许可证号为SCXK（鲁）2019-003）。
1.2药物及试剂
甘草苷（上海源叶生物科技有限公司，批号CAS#551-15-5）;卡托普利片（中孚药业股份有限公司，批号1012016080156）;天狼星红染色液购自北京索莱宝科技有限公司;HE染色试剂盒、TUNEL凋亡检测试剂盒购自上海碧云天科技有限公司;CXCR2单抗购自武汉爱博泰克生物科技有限公司，p-NF-κB抗体购自美国Abcam公司;IL-1β、IL-17试剂盒购自武汉酶免生物科技有限公司。
1.3主要仪器
HX-300S型小型动物呼吸机，成都泰盟科技有限公司;PowerLab 数据采集分析系统，澳大利亚AD Instruments;ATOM全自动酶联免疫工作站，意大利MAROCHE;PowerPac电泳仪，美国Bio-Rad公司;Tanon 6600发光成像工作站，上海Tanon公司;Zeiss LSM激光共聚焦显微镜，德国蔡司公司;H-7500型透射电镜，日本日立公司。
2.方法
2.1模型制备
采用前述方法行冠状动脉左前降支结扎术造模。SD大鼠适应性饲养5天后，采用50 mg/kg戊巴比妥钠麻醉，在胸口剃毛暴露出皮肤，在备皮处打开胸腔，挤出心脏，选用6-0 眼科缝合线结扎冠状动脉左前降支，结扎后若观察到大鼠心脏左室壁颜色变浅变白，心电图S-T段抬高伴肢体导联R波高尖，即为造模成功。之后快速将心脏放回胸腔，挤压胸壁排除胸腔气体后逐层缝合关胸。假手术组大鼠只穿线不结扎。造模过程中采用小动物呼吸机辅助呼吸，术后给予每只大鼠每天腹腔注射8万单位的青霉素溶液，连续3d，防止感染。
2.2 分组与给药
造模24 h后，除假手术组外（8只大鼠），其余造模成功的大鼠随机分为模型组、LIQ（25、50、100 mg/kg）组、卡托普利（2.5 mg/kg）组，每组8只。各给药组每天按照10 ml/kg的体积予以灌胃，每天1 次，连续28 天，假手术组与模型组给予等体积纯净水灌胃。
2.3 指标检测
（1）心臟血流动力学检测。末次给药后30min，称量并记录各大鼠体重，随后用1% 戊巴比妥钠以50 mg/kg剂量经腹腔注射麻醉各组大鼠，并通过右劲动脉向左心室插管，采用PowerLab 数据采集分析系统检测左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张末期压（LVEDP）、左心室压力最大收缩率（+dp/dtmax）和左心室压力最大舒张率（-dp/dtmax）。（2）心脏重量指数HWI 检测。心脏血流动力学检测结束后，腹主动脉取血，迅速摘取心脏，分离脂肪组织、主动脉和心房，称量心脏重量（mg），计算心脏重量指数HWI（心脏重量mg/体重g）。（3）HE染色。将心肌组织放入4% 的多聚甲醛中固定24 h以上，取出组织剪修平整之后，放入脱水盒里进行梯度酒精脱水、二甲苯透明和浸蜡，随后进行包埋，制备4 μM厚心肌组织切片，采用苏木素和伊红进行HE染色，电子显微镜下观察大鼠心肌组织病理变化情况。（4）天狼星红染色。如2.3.3步骤，制备6μm厚心肌组织切片，采用Weigert铁苏木素染色液染色10 min，自来水冲洗5 min后天狼星红染色1 h，常规脱水透明，中性树胶封固，随机选取一个视野运用显微镜（400×）拍照，观察大鼠心肌组织胶原纤维变化情况。（5）TUNEL染色。将固定好的心脏组织切成4μm厚的切片，根据TUNEL试剂盒说明书操作，用常规的二甲苯溶液脱蜡，不同浓度梯度的乙醇溶液依次水化，滴加20 μg/ml浓度的蛋白酶K（无DNase）于37 ℃孵育15 min，PBS洗涤3次，加50 μl TUNEL测定溶液于切片中，37 ℃避光温育60 min。置于PBS中用摇床震摇漂洗3次，每次5 min，加入DAPI溶液显色5 min，之后再进行PBS漂洗，随后加滴加适量防荧光淬灭剂，甩干后，滴加树脂封片剂进行封片，进行荧光定量分析，使用荧光显微镜显微镜630×倍视野下拍照计数阳性凋亡细胞数，评价大鼠心肌组织细胞凋亡情况。（6）Western Blot 检测心肌组织CXCR2、NF-κB p65、p-NF-κB p65的表达。称取50 mg心肌组织，加入RIPA细胞裂解液，提取总蛋白，经SDS-PAGE电泳上样， 80 V电泳30 min，观察样品进入分离胶后将电压调至120 V，待目的条带到达合适位置的时候（依据Maker的位置）结束电泳，经转膜、封闭、洗涤后，加入一抗4 ℃孵育过夜，二抗孵育1h，曝光，使用Image Pro Plus 6.0软件分析，实验重复3次，计算CXCR2、p-NF-κB p65蛋白相对表达量。（7）免疫荧光检测CXCR2表达。将组织切片放入含有柠檬酸抗原修复液的修复盒中进行抗原修复，洗涤后进行BSA封闭，4℃下加入一抗（1：500）过夜，在室温下滴加二抗（1：1000）孵育60 min，PBS洗涤后，滴加DAPI染色液进行染色。使用荧光显微镜在630× 倍视野下随机选择视野进行拍照。（8）ELISA法检测心肌组织IL-1β、IL-17水平。取心肌组织，匀浆后3500×g离心10 min，取上清液，按照ELISA试剂盒说明书操作，于酶标仪检测组织中IL-1β、IL-17水平含量。EF1E75D4-20DC-4ED4-A497-2DE08B31D4E8
2.4 统计学方法
采用SPSS 23.0统计软件对实验数据进行分析，GraphPad Prism 8.0进行数据分析图的绘制。计量资料采用均数±标准差（x-±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，Tukey多组间两两比较，统计结果以P<0.05表示两组之间差异具有统计学意义。
3.实验结果
3.1 LIQ对心梗后心室重构大鼠血流动力学的影响
如图1（注：##P<0.01 vs Sham，** P<0.05，P<0.01 vs Model）所示，与假手术组比较，模型组大鼠LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax显著降低（P<0.01），LVEDP显著升高（P<0.01）;与模型组比较，LIQ 各剂量组及卡托普利组LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax均有显著升高（P<0.05，P<0.01），LVEDP显著降低（P<0.05，P<0.01），且LIQ对模型大鼠的血流动力学指标影响具有剂量依赖性。提示LIQ可改善心梗后心室重构大鼠各项心脏功能指标。
3.2 LIQ对心梗后心室重构大鼠心脏重量指数（HWI）的影响
如图2（注：##P<0.01 vs Sham，** P<0.05，P<0.01 vs Model）所示，与假手术组比较，模型组大鼠心脏HWI显著升高（P<0.01），提示经造模后大鼠心脏出现了扩张;与模型组比较，LIQ 各剂量组及卡托普利组均能显著降低HWI指数（P<0.05，P<0.01），且LIQ对模型大鼠的HWI指数的降低具有剂量依赖性。LIQ 100 mg/kg剂量组对心梗后心室重构大鼠的心脏功能及心肌扩张的改善作用最为明显，故取100 mg/kg剂量组动物组织进行进一步的作用机制研究。
3.3 LIQ对心梗后心室重构大鼠心肌组织病理形态学的影响
显微镜下观察每组大鼠心肌组织的HE染色切片，结果图3所示，假手术组心肌组织排列整齐，细胞结构完整，细胞核形态正常，心肌间质无炎性细胞浸润及心肌纤维变性坏死等病理性改变;模型组大鼠心肌组织边限不清，核固缩或碎裂，胞浆破裂，心肌纤维排列杂乱或断裂，纹理不清，心肌间质炎性细胞浸润;经LIQ或卡托普利组治疗后，上述情况得到改善，大多数心肌纤维排列整齐，结构清晰。提示LIQ可以减轻模型中炎性细胞的浸润及心肌结构的破坏。
3.4 LIQ对心梗后心室重构大鼠心肌组织胶原纤维变化的影响
胶原蛋白作为细胞外基质的主要成分，其变化能够反应心室重构的病理改变程度。显微镜下观察各组大鼠心肌组织天狼星红染色切片，结果图4所示，假手术组大鼠心肌组织可见少量红染丝状纤维，无明显的红色胶原沉积，肌丝排列有序;模型组大鼠心肌组织可看到有大量的红色胶原纤维沉积，呈束状浸润性分布，肌丝排列紊乱;LIQ或卡托普利的治疗改善了上述病理改变，胶原沉积明显减少。表明LIQ可以減轻心肌间质胶原的过度沉积。
3.5 LIQ对心梗后心室重构大鼠心肌组织细胞凋亡的影响
假手术组有极少数的阳性凋亡细胞（红色荧光）;与假手术组相比，模型组大鼠心肌组织阳性凋亡细胞（红色荧光）明显增加，心肌细胞凋亡率显著上升（P<0.01）;与模型组相比，LIQ或卡托普利组大鼠心肌组织凋亡细胞明显减少，心肌细胞的凋亡率降低（P<0.01），表明LIQ可在一定程度上减轻细胞的凋亡。
3.6 LIQ对心肌组织CXCR2、p-NF-κB p65表达的影响
Western blot检测结果表明，在心室重构模型大鼠心肌组织中CXCR2、p-NF-κB p65蛋白表达显著升高，与假手术组比较具有显著性差异（P<0.01）;与模型组相比，LIQ组及卡托普利组大鼠心肌组织CXCR2、p-NF-κB p65蛋白表达显著降低（P<0.01），提示LIQ对心室重构模型大鼠心肌损伤保护与调控CXCR2/NF-κB轴有关。
3.7 免疫荧光检测LIQ对心肌组织CXCR2表达的影响
免疫荧光结果发现，假手术组中的CXCR2（绿色荧光标记）荧光强度较低，表达量较少;与假手术组相比，模型组绿色荧光强度增强，CXCR2表达量显著升高（P<0.01）;与模型组相比，LIQ和卡托普利组荧光强度降低，CXCR2表达量显著下降（P<0.01）。表明LIQ可以调控CXCR2的表达。
3.8 LIQ对心肌组织炎症因子IL-1β、IL-17含量的影响
模型组大鼠心肌组织中炎症因子IL-1β、IL-17含量显著升高，与假手术比较具有显著差异（P<0.01）;与模型组比较，LIQ和卡托普利组的IL-1β、IL-17含量显著降低（P<0.01）。表明LIQ能够有效的抑制心肌组织炎症因子的水平。
4.讨论
急性心肌梗死是严重危害人类健康的重大疾病，是导致心衰的最重要病因，在我国心梗发作7天内出现心衰的概率为19.3%，年龄超过65岁的患者心梗后5年内的心衰发病率更是高达75.9%。而心室重构作为心梗后心衰形成的必经病理过程，能使心脏发生进行性扩张和外形改变，引起血流动力学该改变、心肌组织肥大、炎症浸润、过度纤维化、心肌细胞坏死等，最终导致心衰。因此，抑制心室重构的病理过程已成为防治心衰的重要策略和研究热点。
研究发现急性心肌梗死会导致复杂的炎症反应，伴随着细胞因子的分泌和炎症细胞向梗塞心肌区域的趋化募集，加速心室重构的发生。而抑制心肌组织炎症反应是改善心室重构，抑制心衰发生的重要手段。趋化因子是一大家族的趋化蛋白，具有控制免疫细胞向受损组织募集的作用。在人类中，已发现50多种区划因子和19种受体，这些趋化因子根据N端半胱氨酸残基的排列分为四个亚家族：CXC、CC、XC和CX3C，通过与跨膜G蛋白偶联受体家族的特定细胞表面受体结合发挥生物学效应，调节免疫细胞的迁移、粘附等。近年来研究发现，趋化因子介导的单核细胞浸润受损心脏是心室重构过程中炎症反应第一步，而CXCR2作为单核细胞募集的核心驱化因子，在心室重构发生过程中发挥重要作用。如血管紧张素 II诱导的心脏单核细胞浸润主要由 CXCL1-CXCR2 信号介导，并启动和加重心脏重构;CXCR2可通过调控多种细胞信号通路如NF-κB、AKT/mTOR、ERK1/2、TGF-β/Smad2/3等引起自发性高血压大鼠单核细胞、巨噬细胞向心肌募集，产生促炎因子及活性氧，导致心脏心室重构与收缩功能障碍等。NF-κB是一种重要的核转录因子，在调节各种炎性细胞因子的表达方面起着关键作用。EF1E75D4-20DC-4ED4-A497-2DE08B31D4E8
甘草是我国传统中药之一，现代药理学研究表明其具有抗炎、抗氧化、免疫调节、抗癌等多种活性，常作为佐使药在中药复方中应用，在慢性心力衰竭的中医药治疗中，甘草使用频率排前5位。而甘草苷是甘草的主要有效成分之一，能够调控TLR4/MyD88/NF-κB通路、SIRT3/ROS/NF-κB通路，降低UVB照射导致的动物皮肤炎症反应，抑制骨癌痛大鼠CXCL1/CXCR2信号通路的激活抑制IL-1β、IL-17的产生，发挥抗炎镇痛作用;能够调节AMPKa2依赖性信号通路，下调TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表达，减轻脂多糖诱导的心肌细胞损伤等，发挥着抗炎及心脏保护作用。
本研究发现大鼠经左冠脉结扎后出现LVSP、+dp/dtmax、–dp/dtmax降低， LVEDP升高，心脏形态变大，HWI升高，心肌组织可见明显的细胞排列紊乱、炎性细胞浸润、心肌间质胶原过度沉积、心肌细胞凋亡等经典的心梗后心室重构的血流动力学、形态学及病理学改变。另模型大鼠心肌组织CXCR2、p-NF-κB p65蛋白表达水平显著升高，炎症因子IL-1β、IL-17含量明显增加。心梗后CXCR2上调使炎性细胞向受损心肌组织浸润，从而激活NF-κB通路，促进炎症因子IL-1β、IL-17的释放，介導受损心肌组织的炎症效应，表明CXCR2/NF-κB轴参与了心梗后心室重构进程。给予模型动物LIQ灌胃治疗，发现LIQ可剂量依赖性的改善左冠脉结扎后模型大鼠心室重构相关的血流动力学、心脏形态的改变，选择最佳剂量组进行进一步研究，结果显示LIQ能够改善模型大鼠的病理学改变，下调心肌组织CXCR2、p-NF-κB p65蛋白表达，抑制炎症因子IL-1β、IL-17的释放。本研究证明了甘草苷对心梗后心室重构模型大鼠具有明显的保护作用，且其作用机制可能与调控CXCR2/NF-κB信号轴介导的炎症因子释放有关。
参考文献：
[1]中国医师协会心血管内科医师分会，等.2020心肌梗死后心力衰竭防治专家共识[J].中国循环杂志，2020，13（12）：1166-1180.
[2]梅晓苑.中医药治疗慢性心力衰竭的用药规律探讨[D].辽宁中医药大学，2020.6.
【作者简介】莫佳佳（1987.04-），男，侗族，广西柳州市人，硕士研究生学历，合肥医工医药股份有限公司研究员，主要研究方向：心脑血管药物开发及产业化。
【通讯作者】王翔（1988.02-），女，安徽阜阳市人，博士学位，安徽中医药大学副教授，主要研究方向：中药药理学基础。
【基金项目】国家自然科学青年基金（No 82004180）;安徽省高校自然科学研究重点项目（No KJ2020A0393）;安徽省高校优秀青年人才支持计划项目（No Gxyq2020020）。EF1E75D4-20DC-4ED4-A497-2DE08B31D4E8
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