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猪源嗜酸乳杆菌La-0231分离鉴定及其特性分析

时间:2023-06-15 19:30:03 来源:网友投稿

宋士良

(上海邦成生物工程有限公司,上海 201506)

嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus),1900年首先从婴儿粪便中分离出来,当时被命名为嗜酸芽孢杆菌(Bacillus acidophilus)。1970年经Hanson和Moquot重新鉴定、分类后,修改为现在的名称,属于乳杆菌属,革兰氏阳性杆菌(Widyastuti等,2014)[1]。嗜酸乳杆菌是少数可以存活并定植于人或动物肠道内的益生菌之一,其在肠道内的定植能力强于其它微生物。它能竞争性地定植于小肠上皮细胞,产生细菌素和有机酸,维持肠道内低pH环境,促进肠道中微生态环境的正常化(Scapin等,2013)[2]。嗜酸乳杆菌作为动物肠道中重要的益生菌,具有维护动物肠道健康、缓解不良应激、改善饲养环境、调节机体脂肪代谢和改善畜禽产品品质等功能(胡国才等,2013)[3]。La-0231菌株分离自仔猪新鲜粪便,经16SrDNA测序及生理生化特性鉴定确认其为嗜酸乳杆菌。

1.1 试验材料

1.1.1 分离源仔猪新鲜粪便。

1.1.2 分离培养基MRS(含溴甲酚紫)固体培养基:葡萄糖20g,蛋白胨10g,牛肉浸膏10g,酵母浸粉5g,柠檬酸氢二铵2g,K2HPO42g,NaAc·3H2O 5g,MgSO4·7H2O 0.58g,MnSO4·4H2O 0.25g,吐温80 1mL,蒸馏水定容1000mL,琼脂20g,pH6.0~6.5,0.6%溴甲酚紫1mL。

1.1.3 牛奶管保种培养基脱脂奶粉10g,酵母膏2g,葡萄糖1g,蒸馏水100mL。

1.1.4 鉴定培养基MRS固体培养基:葡萄糖20g,蛋白胨10g,牛肉膏10g,酵母浸粉5g,柠檬酸氢二铵2g,K2HPO42g,NaAc·3H2O 5g,MgSO4·7H2O 0.58g,MnSO4·4H2O 0.25g,吐温80 1mL,蒸馏水定容1000mL,琼脂20g(MRS液体培养基不加琼脂),pH6.0~6.5。

1.1.5 细菌生化鉴定管 苦杏仁苷、水杨苷、七叶灵、纤维二糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、棉籽糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、甘露糖、接触酶等的细菌生化鉴定管。

1.1.6 定量抗生素纸片标准品 实验用定量抗生素纸片标准品,由中国食品药品检定研究院出品。

1.1.7 实验动物 选用健康成年ICR小鼠80只,雌雄各半,雌性小鼠体重范围17.92g~21.89g,雄性小鼠体重范围19.20g~22.79g。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株分离纯化步骤

①将采集的仔猪新鲜粪便逐级稀释,取0.1mL稀释液涂布于MRS(含溴甲酚紫)固体培养基平板(下同)上,37℃兼性厌氧培养2d。

②将培养好的平板取出,选取所有菌落形态为黄色、表面湿润、平凸、边缘整齐、大小在0.5mm~2.5mm的单菌落,对应作标记,在无菌条件下挑取作记号的菌落,革兰氏染色,保留镜检形态为杆菌、两端圆、大小通常为0.6μm×1.5μm~0.9μm×6.0μm,以单个、成双或短链出现的单菌落,并将平板上保留的单菌落标记为嗜酸乳杆菌疑似菌株。

③将疑似菌株采用划线的方式转接到空白平板上,37℃,兼性厌氧培养2d,进行初步的菌株纯化。

④选取上述相同菌落形态的单菌落,再划线转接到空白平板上,37℃兼性厌氧培养2d,进一步对菌株进行纯化。反复多次,直至镜检无杂菌。

⑤选取上述相同菌落形态的单菌落,转接到保种牛奶管中,37℃兼性厌氧培养15h,2℃~4℃冰箱冷藏保存备用。

1.2.2 菌种鉴定

①生理生化特性鉴定。采用细菌生化鉴定管法测定。

②16SrDNA测序。分离、纯化菌种,委托上海美吉生物医学科技有限公司进行测序,经16SrDNA基因作为Marker片段,通用引物扩增出基因中16SrDNA序列,再进行电泳检测,使用3730XL测序仪进行一代双末端测序,获得abi测序峰图文件,通过软件组装后,与NT数据库进行比对,获得近源物信息。

1.2.3 抗生素敏感试验 采用K-B法测定。

1.2.4 菌株毒力试验

①培养物制备。将嗜酸乳杆菌La-0231菌株转接至MRS固体培养基上,37℃兼性厌氧培养48h;
挑取单菌落转接至MRS液体培养基中,37℃兼性厌氧培养48h后,将部分培养液常温下浓缩5倍备用,其余直接供实验用。

②活菌计数。无菌吸取上述①中培养液1mL,加入9mL无菌生理盐水稀释液中混匀,并进行10倍梯度稀释,选择合适的2~3个稀释度,吸取0.1mL稀释液分别涂布于MRS固体培养基平板上,每个稀释度2块平板,置37℃,兼性厌氧培养48h,计数。

③小鼠毒力试验。小鼠80只,雌雄各半,分别随机分为4组。剂量组设置为:培养基空白对照组、培养基5倍浓缩空白对照组、培养物原液组、培养物5倍浓缩组。将受试物以0.02mL/g体重的剂量给小鼠灌胃,连续灌服3d,观察7d,记录实验过程中小鼠的中毒表现或死亡情况。

1.3 试验数据统计

以下试验数据均为2次重复的平均值,数据经过Excel 2016处理后,定量测定数据利用SPSS 21.0统计软件进行方差分析,差异显著时采用Duncan’s法进行多重比较,试验结果以“平均值±标准差(±s)”表示,显著性水平为0.05。

2.1 菌株分离鉴定

2.1.1 菌株分离纯化

试验采用仔猪新鲜粪便,逐级稀释涂布平板培养,从菌落形态、菌体显微形态、革兰氏染色着手挑取单菌落,再经反复多次划线分离菌种,获得纯化菌株。该纯化菌株菌落形态、菌体显微形态和革兰氏染色特征见图1。

图1 纯化菌株菌落形态、菌体显微形态和革兰氏染色特征

2.1.2 生理生化特性鉴定结果

采用划线的接种方式,将牛奶管中保存的菌种,转接到MRS固体培养基平板上,37℃兼性厌氧培养2d,进行菌种纯化。挑取培养好的单菌落,转接到MRS固体培养基平板上,37℃兼性厌氧培养2d,收集培养好的菌苔,进行菌种的细菌生化管鉴定。鉴定结果见表1。

表1 嗜酸乳杆菌La-0231菌株细菌生化管鉴定结果

从表1的检测结果可以看出,La-0231菌株能利用葡萄糖产乳酸;
接触酶阴性;
能在pH4.5,15℃~45℃温度环境下,厌氧或好氧生长;
能发酵牛奶产酸凝固;
能利用苦杏仁苷、水杨苷、七叶灵、纤维二糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、棉籽糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、甘露糖等碳水化合物产生乳酸。生理生化特性鉴定为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。

2.1.3 16SrDNA测序结果

采用划线的接种方式,将牛奶管中保存的菌种,转接到MRS固体培养基平板上,37℃兼性厌氧培养2d,进行菌种纯化。挑取培养好的单菌落,转接到MRS固体培养基平板上,37℃兼性厌氧培养2d。分离、纯化好的菌种,经16SrDNA基因作为Marker片段,通用引物扩增出基因中16SrDNA序列,获得其特征序列图,见图2。

从图2的测序结果可以看出,La-0231菌株其16SrDNA序列为1460bp,与嗜酸乳杆菌模式菌株KLDS 1.0701进行比对,其16SrDNA基因序列相似性达99.86%,鉴定结果为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。

图2 嗜酸乳杆菌La-0231菌株16Sr DNA特征序列

2.2 菌株特性分析

2.2.1 抗生素敏感性测试结果

采用K-B法,测定嗜酸乳杆菌La-0231菌株对30种抗生素的敏感性。检测结果见表2。

表2 嗜酸乳杆菌La-0231菌株对30种抗生素的敏感性测试结果

从表2的测试结果可以看出,嗜酸乳杆菌La-0231菌株对青霉素、羧苄青霉素、四环素、庆大霉素、氯霉素、阿奇霉素、卡那霉素、链霉素、强力霉素、克拉霉素、氯霉素、头孢曲松、头孢哌酮、呋喃妥因、头孢噻吩、头孢他啶、头孢克洛、头孢唑啉、头孢噻肟、阿莫西林、哌拉西啉、复方新诺明敏感;
对环丙沙星、氧氟沙星、阿米卡星、妥布霉素、阿米卡星中度敏感;
对氟罗沙星、洛美沙星、诺氟沙星不敏感。

2.2.2 菌株毒力测试结果

①培养物原液中活菌计数结果

将嗜酸乳杆菌La-0231菌株转接至MRS液体培养基中,37℃兼性厌氧培养48h后,对培养物原液进行10倍梯度稀释,平板计数,结果见表3。

表3 嗜酸乳杆菌La-0231菌株培养物原液中活菌计数结果

从表3的检测结果可以看出,培养物中的活菌数为2.65×108CFU/mL或2.70×108CFU/mL,两个稀释度检测结果无显著性差异(P>0.05)。

②培养物对小鼠体重的影响

将嗜酸乳杆菌La-0231菌株转接至MRS液体培养基中,37℃兼性厌氧培养48h后,将部分培养液常温下浓缩5倍,其余培养液直接供试验用。分别试验对雄性小鼠体重和雌性小鼠体重的影响。结果见表4、表5。

表4 嗜酸乳杆菌La-0231菌株培养物对雄性小鼠体重的影响

从表4的检测结果可以看出,雄性小鼠的初始体重和终体重在培养物组与其相应的对照组间比较,差异均无显著性(P>0.05)。即在试验期间,嗜酸乳杆菌La-0231菌株培养物对雄性小鼠体重无影响。

表5 嗜酸乳杆菌La-0231菌株培养物对雌性小鼠体重的影响

从表5的检测结果可以看出,雌性小鼠的初始体重和终体重在培养物组与其相应的对照组间比较,差异均无显著性(P>0.05)。即在试验期间,嗜酸乳杆菌La-0231菌株培养物对雌性小鼠体重无影响。

③活菌对小鼠毒性作用结果

将受试物以0.02mL/g体重的剂量给小鼠灌胃,连续灌服3d,观察7d,记录实验过程中小鼠的中毒表现或死亡情况。结果见表6。

表6 嗜酸乳杆菌La-0231菌株活菌对小鼠毒性作用情况

从表6的检测结果可以看出,以0.02mL/g体重剂量嗜酸乳杆菌La-0231菌株活菌培养物(原液和浓缩液),给小鼠灌胃,连续灌服3d,观察7d,未见受试小鼠有毒性反应或死亡情况。

3.1 菌株分离鉴定

张雅茹等(2017)从青海酸奶中分离出一株嗜酸乳杆菌,经细菌形态学和16SrDNA序列同源性分析鉴定确认,并对其进行了降血脂的研究[4]。吴家鑫等(2019)从广西桂林市黄洛瑶寨地区淘米水发酵液中分离得到3株嗜酸乳杆菌疑似菌株,其中3号菌株菌落形态、显微形态、革兰氏染色符合嗜酸乳杆菌特征;
46项生理生化指标与嗜酸乳杆菌接近,鉴定可信度达到90%;
经过16SrDNA鉴定后,其与嗜酸乳杆菌的同源性高达99%,确认其为嗜酸乳杆菌,命名为CFC-001[5]。王丽等(2017)从健康鸡肠道中分离获得3株疑似乳杆菌,并对其分别命名。通过对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌试验,以及耐受性试验获得一株益生效果较高的菌株S-3,通过传统的形态、生理生化方法和16SrDNA分子鉴定,确定S-3为嗜酸乳杆菌[6]。蔡熙姮等(2020)从蓝狐的肠道内容物中分离到1株优势乳酸菌,命名为ZJBF300。经菌落形态、生理生化特性和16SrRNA基因序列分析将其鉴定为嗜酸乳杆菌[7]。胡国才等(2015)从仔猪新鲜粪便中分离纯化了1株嗜酸乳杆菌菌株La-5,通过逐步提高培养基酸度、胆盐浓度和培养温度,对分离菌株进行驯化,获得一株具有耐低pH、高浓度胆盐及高温特性的菌株La-5c[8]。杜志琳等(2016)从健康猪肠道内容物中分离获得5株疑似乳杆菌菌株,通过生理生化和分子生物学鉴定方法,综合确定其中一株菌为嗜酸乳杆菌,命名为HEW-A701。并对其耐酸性能、耐胆盐性能和对致病菌拮抗性能进行研究[9]。张艳萍等(2017)从健康仔猪粪便中分离获得9个菌株,通过对菌株形态及生理生化特性鉴定,得到2株疑似嗜酸乳杆菌菌株,分别命名为L102和L106,通过16SrDNA分析表明,菌株L102和L106均为嗜酸乳杆菌,并对2株菌的益生特性进行研究[10]。梁东梅等(2018)选取健康猪粪便,利用选择性培养基进行厌氧培养和单克隆纯化,共获得3株乳酸杆菌,通过生化鉴定、16SrRNA基因序列测定和同源性分析,确定其中一株分离菌株为嗜酸乳杆菌。采用牛津杯法、活菌计数法和细胞试验等研究了其体外抑菌活性、黏附性及竞争性黏附猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)的益生特性[11]。本试验从菌落形态、菌体显微形态、革兰氏染色着手,分离、纯化菌种,通过生理生化特性和16SrDNA基因序列分析,将其鉴定为嗜酸乳杆菌,命名为La-0231菌株。

3.2 菌株特性分析

杜金城(2017)测试了4株嗜酸乳杆菌(KLDS1.0901、1.0902、1.1003和NCFM)对10种抗生素(青霉素、阿莫西林、庆大霉素、链霉素、卡那霉素、红霉素、四环素、利福平、万古霉素和氯霉素)的敏感性,结果KLDS1.0901菌株对氨基糖苷类的庆大霉素、链霉素和卡那霉素耐受,对其余7种抗生素敏感;
KLDS1.0902菌株对庆大霉素和卡那霉素耐受,对其余8种抗生素敏感;
KLDS1.1003菌株与KLDS1.0902菌株一致;
NCFM菌株对庆大霉素、链霉素和卡那霉素耐受,对四环素和利福平中介,对其余5种抗生素敏感[12]。于鸿晶等(2019)采用最低抑菌浓度法检测嗜酸乳杆菌YIT2004菌株对抗生素的敏感性,提取YIT2004菌株基因组,用特异性引物对耐药基因进行PCR扩增。结果显示嗜酸乳杆菌YIT2004菌株对青霉素、氨苄西林、亚胺培南、庆大霉素、红霉素和克林霉素敏感,对万古霉素固有耐药且其耐药性不可传递[13]。本试验采用K-B法,测定了嗜酸乳杆菌La-0231菌株对30种抗生素的敏感性,结果显示其对22种抗生素敏感,对5种抗生素中度敏感,对3种抗生素不敏感。毒力试验测试结果说明,嗜酸乳杆菌La-0231菌株培养物对雄性和雌性小鼠体重无影响;
以0.02mL/g体重剂量活菌培养物(原液和浓缩液),给小鼠灌胃,未见受试小鼠有毒性反应或死亡情况。

本试验采用仔猪新鲜粪便,从菌落形态、菌体显微形态、革兰氏染色着手,分离、纯化菌种,通过生理生化特性和16SrDNA基因序列分析,将分离纯化菌株鉴定为嗜酸乳杆菌,命名为La-0231菌株。采用K-B法,测定了嗜酸乳杆菌La-0231菌株对30种抗生素的敏感性,结果显示其对青霉素、羧苄青霉素、四环素、庆大霉素、氯霉素、阿奇霉素、卡那霉素、链霉素、强力霉素、克拉霉素、氯霉素、头孢曲松、头孢哌酮、呋喃妥因、头孢噻吩、头孢他啶、头孢克洛、头孢唑啉、头孢噻肟、阿莫西林、哌拉西啉、复方新诺明敏感;
对环丙沙星、氧氟沙星、阿米卡星、妥布霉素、阿米卡星中度敏感;
对氟罗沙星、洛美沙星、诺氟沙星不敏感。毒力试验测试结果说明,嗜酸乳杆菌La-0231菌株对动物安全,是一株有待开发利用的猪源嗜酸乳杆菌。

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