孔维嘉，陈佳祺，张文旭，商 钰，薛雨辛，朱庆文
雄激素性脱发（androgenetic alopecia，AGA）是一种与遗传因素及雄激素依赖相关的常见毛发疾病，属于中医学 “发蛀脱发”“蛀发癣”等范畴。中国雄激素性秃发诊疗指南显示，该疾病在我国男性的患病率约为21.3%，女性患病率约为6.0%[1]。AGA多见于青春期后男性，以进行性毛发减少、毛囊的微小化为主要表现，伴皮脂溢出及轻微瘙痒。此疾病严重影响美观，为早发性AGA患者带来身心双重负担[2-4]。
目前美国食品药品监督管理局（FDA）仅批准米诺地尔和非那雄胺作为治疗药品，但使用米诺地尔会出现面部多毛症等不良反应，而非那雄胺则会导致性功能障碍等不良反应[4,5]。研究表明[6,7]，中医对本病有独特的治疗优势。复方透骨草酊由燕京皮肤科专家赵炳南教授经验方透骨草方化裁而来，全方由透骨草（impatiens balsamina）、侧柏叶（platycladi cacumen）、皂角（fructus gleditsia ）、白矾组成，具有祛湿解毒止痒的功效，文献表明原方疗效显著[8,9]。临床研究发现AGA与睾酮及双氢睾酮等雄激素含量密切相关[10]。因此本文用复方透骨草酊处理以睾酮诱导的 C57BL/6 病理脱发小鼠模型，通过测定小鼠毛发生长情况、毛囊细胞凋亡及血清睾酮、双氢睾酮水平等，探究复方透骨草酊促进毛发生长的作用，并为其治疗AGA提供初步实验证据。
1.1 材料
1.1.1 实验动物 雄性C57BL/6 小鼠，6周龄（体重 18～20 g），SPF级，40只[北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK（京）2012-0001]。实验前，稳定饲养1周；
饲养环境：湿度 50%～70%，温度 25 ℃～27 ℃（室温），自然光照。
1.1.2 药物与试剂 复方透骨草酊由透骨草40 g、侧柏叶40 g、皂角15 g、白矾5 g组成（购自北京康泰民生药房）。上述药材碾碎，加入200 ml 75%乙醇，浸泡7昼夜，后采用掺漉法到400 ml，过滤去渣，装瓶备用。睾酮（北京伊诺凯科技有限公司），75%乙醇（杭州欧拓普生物技术有限公司），10%中性缓冲甲醛固定液（浙金械备20170017号），2%米诺地尔搽剂（国药准字H20052642），PH0429抗荧光淬灭封片剂，PH0615蛋白酶K溶液。小鼠睾酮（T）、双氢睾酮（DHT）、小鼠雌二醇（E2）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（江苏科特生物科技有限公司），原位杂交技术原位末端标记法（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒（生工生物工程股份有限公司）。
1.1.3 仪器及设备 伯乐iMark酶标仪（美国Bio-Rad），BSA224S-CW 分 析 天 平（ 德 国 Sartorius），5424R高速离心机（德国Eppendorf），KS 4000 i control 控温摇床（德国IKA），DMI6000 B倒置荧光显微镜、TP1020自动组织脱水机、RM2235切片机、EG1160组织包埋机（德国Leica），CS-VI摊片烤片机、冷冻台（孝感市宏业医用仪器有限公司），移液枪（德国 Eppendorf）。
1.2 方法
1.2.1 动物分组及涂药方法 将40只雄性 C57BL /6小鼠，6周龄，正常喂养1周后，用Excel软件随机分为4组：空白对照组、脱发模型组、米诺地尔酊组、复方透骨草酊组，每组10只小鼠。电动剃须刀物理背部脱毛面积2 cm×3 cm，创伤刺激诱导小鼠毛囊从休止期进入生长期。脱毛后小鼠皮肤呈粉红色，无其他不良反应。脱毛第2天按照对应方法对各组小鼠背部脱毛区域用棉签均匀给药，每天1次。文献[11]显示，脱毛20 d以后小鼠毛囊从新进入休止期，故本实验连续19 d给药。参照文献[12, 13]建立睾酮诱导的病理脱发模型，涂样方法见表1。
1.2.2 观察毛发生长情况 每天观察小鼠皮肤颜色变化，记录小鼠背部实验区皮肤从开始给药到变黑、从开始变黑到毛发长出表皮的时间。以皮肤颜色从粉红色（休止期）到开始变黑（生长期）作为毛发从休止期到生长期的时间；
皮肤开始变黑（生长期）到毛发长出皮肤表面的时间作为毛发从进入生长期到长出皮表的时间[14]。
1.2.3 血清中激素含量的测定 脱毛后第19 d，每组小鼠进行眼球采血，1 500 r/min离心10 min后分离血清，用ELISA试剂盒测定每组小鼠血清中T、DHT以及E2含量，记录并求其平均值。
1.2.4 TUNEL毛囊细胞凋亡检验[15]脱毛后第19 d取血后，将每组小鼠颈椎脱臼法处死，在脱毛部位平行于脊椎处取材，剪去新长出的毛发，后将皮肤修剪成1 cm宽的长条状。置于10%甲醛中浸泡2 d后，用自来水冲去甲醛，自动脱水机脱水，石蜡包埋，修块，切片，使切片方向与毛发生长方向一致，切片厚度为4.5 μm。用TUNEL检测毛囊内细胞的凋亡状况，严格按照红色荧光TUNEL试剂盒说明书操作，具体方法：①二甲苯脱蜡5～10 min 2次；
②滴加 20 μg/ml 蛋白酶 K，无水乙醇，95%乙醇，80%乙醇，蒸馏水分别处理2 min；
③PBS 洗涤玻片去除蛋白酶K；
④根据检测样品数目和表2配制反应混合液；
⑤滴加反应混合液50 μl，37℃避光孵育 60 min；
⑥吸去反应混合物，PBS 洗板3～5次；
⑦用1×Hoechst 33342染色细胞核；
⑧用抗荧光淬灭封片剂封片后荧光显微镜观察并拍照。利用Image Por-plus6.0 图像分析软件，计数红色荧光细胞和区域内总细胞核数量，计算红色荧光细胞所占百分比，即凋亡指数（apoptotic index，AI）。
表2 TUNEL毛囊细胞凋亡检验
1.3 统计学方法
采用统计软件SPSS26.0对实验数据进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验，多组间比较采用单因素方差分析，若有统计学意义，用SNK 法进行两组间检验。如果数据不是正态分布的，则使用非参数Mann-Whitney秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 对C57BL/6 小鼠毛发生长周期的影响
涂药5～7 d后，米诺地尔酊组和复方透骨草酊组小鼠皮肤开始变黑，6～8 d后空白对照组开始变黑，脱发模型组开始变黑时间为7～10 d。米诺地尔酊组和复方透骨草酊组小鼠毛囊从生长期到毛发长出皮表时间为2～4 d，空白对照组及脱发模型组为3～5 d。脱发模型组较空白对照组小鼠毛囊从休止期进入生长期、从生长期到长出表皮时间明显延长（P＜0.05）。统计结果表明，涂抹睾酮对C57BL/6 小鼠的毛发生长具有抑制作用；
复方透骨草酊组及米诺地尔酊组小鼠毛囊从休止期进入生长期、从生长期到长出表皮时间较空白对照组明显缩短（P＜0.05），较脱发模型组时间显著缩短（P＜0.01），提示可从一定程度上缓解睾酮对小鼠毛发生长的抑制作用。各组药物对C57BL/6 小鼠背部毛发生长的影响见表3。涂药第19 d后，脱发模型组毛发再生呈抑制状态，复方透骨草酊组及米诺地尔酊组小鼠恢复毛发再生能力（图1）。
表3 药物对AGA小鼠毛发生长周期的影响（±s，n = 10）
表3 药物对AGA小鼠毛发生长周期的影响（±s，n = 10）
注：与空白组比较，# P＜0.05，## P＜0.01；
与模型组比较，**P＜0.01
组 别 从休止期到生长期时间（d）从生长期到长出皮表时间（d）空白对照组 7.10±0.88 3.70±0.68脱发模型组 8.30±0.95## 4.50±0.71#米诺地尔酊组 6.20±0.63#** 2.90±0.74#**复方透骨草酊组 6.10±0.74##** 2.80±0.92#**
图1 各组小鼠第19 d背部毛发生长情况
2.1 对C57BL/6 小鼠血清中激素水平的影响
与空白对照组相比，脱发模型组小鼠血清中T含量显著升高（P＜0.01），DHT含量明显升高（P＜0.05），E2含量无显著差异（P＞0.05）。与脱发模型组相比复方透骨草酊组的T、DHT含量显著降低（P＜0.01），E2含量没有显著性差异；
米诺地尔酊组T含量显著降低（P＜0.01），DHT含量明显降低（P＜0.05），E2无显著差异（表4）。实验结果表明，涂抹睾酮可诱导小鼠血清中T、DHT含量升高，复方透骨草酊与米诺地尔酊可逆转睾酮引起的小鼠高雄激素水平，对雌二醇无明显作用。
表4 药物对 C57BL/6 小鼠血清中激素含量的影响（±s，n = 10）
表4 药物对 C57BL/6 小鼠血清中激素含量的影响（±s，n = 10）
注：与空白组比较，# P＜0.05，## P＜0.01；
与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
组 别 血清睾酮（T）（nmol/L）血清双氢睾酮（DHT）（nmol/L）血清雌二醇（E2）（pmol/L）空白对照组 288.97±39.38 38.25±5.78 200.54±33.50脱发模型组 355.97±47.72## 48.37±8.09# 216.46±33.60米诺地尔酊组 272.26±52.79** 42.61±8.33* 207.39±36.75复方透骨草酊组 249.84±43.53** 37.94±5.73** 206.77±29.32
1.3 对C57BL/6 小鼠毛囊细胞凋亡的影响
TUNEL细胞凋亡试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况，图2中红色荧光代表凋亡细胞，同时对组织切片进行Hoechst细胞核染色，蓝色荧光代表小鼠毛囊细胞核。脱毛后第19天，与不加反应混合液的阴性组相比，4组切片中均显示荧光染色，表明该实验结果有效。与空白对照组比较，脱发模型组红色荧光明显增强，且区域变大，细胞凋亡指数显著升高（P＜0.01），表明造模成功；
复方透骨草酊组及米诺地尔酊组图像和凋亡指数均差异无统计学意义（P＞0.05）。与脱发模型组相比，复方透骨草酊组及米诺地尔酊组中红色荧光均显著减弱，区域减小，呈星点分散分布，细胞凋亡指数显著降低（P＜0.01），提示复方透骨草酊及米诺地尔酊对C57BL/6小鼠毛囊细胞凋亡均有相似的明显抑制作用（图2，表5）。
图2 药物对C57BL/6 小鼠毛囊细胞凋亡的影响（×200）
表5 药物对C57BL/6 小鼠毛囊细胞凋亡率的影响（±s，n = 10）
表5 药物对C57BL/6 小鼠毛囊细胞凋亡率的影响（±s，n = 10）
注：与空白组比较，## P＜0.01；
与模型组比较，**P＜0.01
组 别 凋亡指数（AI%）空白对照组 29.54±2.86脱发模型组组 51.44±2.16##米诺地尔酊组 16.09±1.60**复方透骨草酊组 17.34±2.20**
正常毛发的生长周期包括生长期、退行期和休止期。T是引起脱发的一种重要雄性激素，在脱发区毛囊内可被Ⅱ型5α-还原酶还原成活性更强的DHT，两者与雄激素受体蛋白结合，进入细胞核使ATP生成受阻，影响细胞能量代谢，毛母细胞角质化成为休止期毛发[10]。破坏毛发正常生长周期，处于退行期及休止期毛囊的比例上升，从而诱发AGA[16]。
复方透骨草酊由燕京皮肤科专家赵炳南教授经验方透骨草方化裁而来，原方由透骨草四两、侧柏叶四两、皂角二两、白矾三钱组成，具有祛湿止痒，解毒消肿的功效。文献显示，原方对AGA等脱发疾病疗效显著，方中透骨草为君药，散风湿、活血止痛，民间有单味透骨草煎汤外洗治疗脱发的经验[17]；
同时凤仙透骨草地上部分化合物具有抗菌、止痒及5α-还原酶抑制作用[18]；
侧柏叶为臣药，助君药凉血祛湿，对球菌、杆菌等有抑制作用[19]。研究表明总黄酮成分能够促进血液循环，同时激活毛母细胞，从而发挥养发生发的作用[20]。钟玲玲等[21]的复方侧柏叶溶液治疗AGA临床试验，总有效率为90.00%；
佐药皂角、白矾，解毒杀虫止痒，对真菌、细菌有抑制作用。本实验在“赵氏皮科酊剂制剂经验”的基础上将水煎剂改为酊剂，能够增强清热止痒、解毒杀虫、活血散瘀的作用，改进后的复方透骨草酊更贴合临床实际。
C57BL/6 小鼠是国内外目前广泛应用的毛发周期动物模型[10,22]。6～8周饲养良好状态下所有毛囊均处于休止期，物理拔毛后同步进入生长期，可通过观察皮肤颜色变化来判断毛发周期。本实验通过每天在小鼠背部涂抹0.1%T溶液建立病理脱发模型[13]，选用复方透骨草酊作为实验组，选用FDA批准治疗AGA的惟一外用药米诺地尔作为西药对照。研究结果显示，T通过延长C57BL/6小鼠毛囊从休止期进入生长期、从生长期到长出表皮时间，从而抑制毛发生长，而复方透骨草酊及米诺地尔酊可通过缩短时间从而促进小鼠毛发的生长。除此之外，笔者比较了小鼠血清中雄激素的含量，复方透骨草酊与米诺地尔酊可降低睾酮刺激引起的T及DHT含量增加，表明复方透骨草酊可能通过降低雄激素水平从而治疗AGA。尽管有文献显示E2会通过改变雄激素代谢影响毛囊生长[23]，然而本实验并未观察到各组之间E2含量存在明显差异，雌激素对毛发生长的影响需要进一步研究。
细胞凋亡是近年来研究毛发生长及周期的热点，毛囊从生长期到休止期是以部分细胞凋亡为特征的程序性器官退化的过程。有研究表明，雄激素诱导转化生长因子-β1表达增加，抑制毛囊细胞生长，促进凋亡[24]。TUNEL细胞凋亡检测，经Hoechst染色后的正常细胞核呈靛蓝色，而凋亡细胞核则呈致密浓染[25-27]，同时显红色荧光。本实验结果显示，复方透骨草酊组与米诺地尔酊组红色荧光减弱、区域减少，且呈蓝色致密浓染的细胞核也减少，凋亡率比脱发模型组显著降低，验证复方透骨草酊及米诺地尔酊通过抑制C57BL/6小鼠毛囊细胞凋亡，从而减少进入退行期及休止期毛囊的比例，延长毛囊生长期，具有防脱发作用。
综上所述，复方透骨草酊能够促进C57BL/6病理脱发小鼠的毛发生长，其作用机制可能与降低血清中T及DHT水平，抑制毛囊细胞凋亡相关。中医药外用治疗皮肤疾病具有整体调节的优势，关于复方透骨草酊对AGA患者自觉症状改善情况（如瘙痒、油腻感等）及用药安全值得今后进一步研究。
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