叶 华， 鲍佐宝， 马 垚 , 张喜玲, 姜城红, 郭元新*
(1.江苏科技大学 粮食学院， 镇江 212100)
(2.安徽科技学院 食品工程学院， 凤阳 233100)
γ-氨基丁酸转氨酶(GABA transaminaseGABA-T，EC2.6.1.19)是植物GABA转化途径中的第一步关键酶，可能与GABA的富集具有一定的联系[1-3].目前，生产上提高植物GABA产量的主要方法是通过改进提取工艺来提高产物收率[4-5]，但不能根本性解决产量问题.有研究表明利用转基因技术控制GABA次生代谢的关键酶基因，通过在目标植物中实现GABA-T支路有关酶的高效表达或截断分支途径关键酶，从而改变代谢流的总量和流向，将显著影响相关GABA的含量[6]，这可以从代谢调控相关基因方向开发GABA高含量苦荞品种.
近年来，高粱[7]、拟南芥[8]、水稻[9]、苹果[10]等植物GABA-T基因相继被克隆出来.然而即使这些GABA-T基因同源性高，但它们都有着非常普遍的发育和组织器官的特异性以及亚细胞状态的多样性[11].很多研究表明，在一些胁迫境环境条件下，GABA-T对GABA的富集发挥着举足轻重的作用[12].如文献[13]研究发现水稻幼苗GABA在130 mM NaCl胁迫下被强烈诱导，同时其GABA-T转录产物含量也明显上升.但目前有关发芽苦荞中GABA-T基因的研究还未见报道.本实验对苦荞进行发芽处理，提取总RNA，然后利用RT-PCR、巢氏PCR 、RACE技术等成功克隆获得了发芽苦荞GABA-T基因，在此基础上对GABA-T基因及其编码的氨基酸进行序列分析及进化树构建，为探讨苦荞GABA的合成代谢基因水平机制提供基础，也为其它植物相关基因的研究提供借鉴意义.
1.1 材料与试剂
苦荞：苦荞一号，四川产，网购于江苏沭阳县新河镇诺之星苗木经营部，购买后置于4～8℃冰箱冷藏备用.
UNIQ-10柱式Trizol总RNA提取试剂盒(B511321)、第一链cDNA合成试剂盒(B532435)、柱式DNA胶回收试剂盒(B518131)、感受态细胞试剂盒(SK2301)、Reverse Transcriptase均购于上海生工生物工程股份有限公司，试验所用引物也由上海生工生物工程股份有限公司合成；
LA Taq酶、 pMD18-T载体购自TaKaRa Biotechnology (Dalian)公司；
DNA分子量Marker: Marker(B600032)购自BBI(Bio Basic Inc)公司；
其他化学试剂均为国产或进口分析纯.
1.2 仪器和设备
PCR反应扩增仪，加拿大BBI公司；
WS-150恒温恒湿培养箱，上海森信实验仪器有限公司；
SW-CJ-1D洁净工作台，江苏苏洁净化设备厂；
DK-8D型电热恒温水槽，上海森信实验仪器有限公司；
DYY-8型稳压稳流电泳仪，上海琪特分析仪器有限公司；
YXJ-2离心机，湘仪离心机仪器有限公司；
H6-1微型电泳槽，上海精益有机玻璃制品仪器厂；
凝胶成像系统，Gene Genius公司；
U-3010紫外-可见分光光度计，Hitachi公司；
移液器，加拿大BBI公司.
1.3 发芽苦荞制备
发芽苦荞制备方法参考文献[14]处理进行制备，具体操作如下：取适量苦荞种子，水浴浸泡(30 ℃)4 h后置于恒温恒湿培养箱中进行发芽(温度30 ℃，湿度90%)5 d，期间每隔8 h换水1次，当苦荞芽长至2～5 mm时，去除外壳，直接用于总RNA的提取.
1.4 引物合成及测序
本研究在前期获得苦荞转录组测序结果的基础上，确定苦荞GABA-T的中间序列，根据中间序列设计了3个接头引物，即3’adaptor，5.3’outer，5.3’inner，以及一对特异性引物，即RC491-GABA-F1和RC491-GABA-F2，引物合成和测序均由上海生工生物工程股份有限公司完成.引物设计结果见表1.
表1 引物设计
1.5 发芽苦荞总RNA的提取
将1.3步骤制备的发芽苦荞用于总RNA的提取，具体提取方法步骤参照上海生工UNIQ-10柱式Trizol总RNA提取试剂盒要求进行.提取的总RNA分别用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行电泳分析，同时用紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm以确保在1.8～2.0之间.
1.6 发芽苦荞cDNA 第1链的合成
将发芽苦荞总RNA反转录合成第一链cDNA，具体操作按照第一链cDNA合成试剂盒进行.
1.7 3′ RACE获得目的基因的3′端
1.7.1 目的cDNA的扩增
目的cDNA扩增分两轮进行：第一轮分别以RC491-GABA -F1和5.3’outer为发芽苦荞GABA-T基因cDNA的正、反向引物，以GABA-T基因cDNA为模板，进行PCR扩增(95℃预变性3 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸60 s，72℃ 7 min，33个循环)；
第二轮巢氏PCR扩增则以第一轮扩增产物为模板，分别以RC491-GABA -F2和5.3’inner作为GABA-T基因cDNA正、反向引物进行第二轮PCR扩增(95℃预变性3 min，94℃变性30 s，58℃退火58 s，72℃延伸60 s，72℃ 7 min，33个循环)，从而得到目的基因3’末端，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行验证.具体PCR反应条件如表2.
表2 PCR反应体系组成
1.7.2 目的片段的回收、纯化、载体连接及转化
PCR产物电泳后采用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行回收纯化.将纯化后的目的片段按照操作说明连接到pMD18-T载体上并进行感受态细胞(SK2301)转化.
1.7.3 菌落PCR及测序
以蓝白斑法从转化平板上随机挑取阳性单克隆，接入1 mL含有100 μg/mL Amp 的LB液体培育基中，在220 r/min转速、37 ℃条件下摇床培养8～10 h后，以菌液为模板，以pMD18-T载上的通用引物进行PCR扩增(95 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，72 ℃ 10 min，25个循环).扩增产物送上海生工生物工程有限公司进行测序.具体PCR反应体系见表3.
表3 菌落PCR反应体系
2.1 发芽苦荞总RNA电泳结果
发芽苦荞总RNA琼脂糖凝胶电泳图见图1(a).从图可以很明显地看到28S和18S条带，并且此时其亮度比值为2∶1，由此说明RNA基本稳定未降解，可用于下一步试验.
图1 电泳图
2.2 3’端扩增结果及序列拼接序列分析
图1(b)为3’端RACE扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果.由图可以看到一条大小约为305 bp的条带，将该目的片段进行测序.随后将其与苦荞转录组测序结果获得的中间序列进行拼接，得到长度为1 556 bp的苦荞GABA-T基因的全长序列(表4). 利用ORF finder工具分析发现该发芽苦荞GABA-T序列包含一个完整的1 347 bp(21-1 367)的开放阅读框即CDS序列和长306 bp (1 251～1 556)的3’RACE扩增序列；
且GABA-T基因编码448个氨基酸(表5).这与ProtParam(https://web.expasy.org /protparam/)程序预测发芽苦荞GABA-T基因结果相同，其分子量为49.19 kDa，理论等电点(pI)为6.28.
表4 发芽苦荞GABA-T基因cDNA序列
表5 发芽苦荞GABA-T基因CDS区所推导氨基酸序列
2.3 发芽苦荞GABA-T基因编码的蛋白质同源性分析
利用BLAST和DNAMAN软件对发芽苦荞GABA-T基因编码的蛋白质与藜麦、甜菜等10种植物来源的GABA-T基因编码的蛋白质进行同源性性分析和序列对比分析，结果见图2.由图2可以看出发芽苦荞GABA-T基因编码的蛋白质与菠菜(XP_021843601.1)和欧洲栓皮栎树GABA-T基因编码的蛋白(XP_023870495.1)序列具有较高的相似度，其相似度分别达87.05%和86.83%.
图2 GABA-T编码氨基酸序列多重比较分析
(注释：上图中左侧基因编号标注依次为：Fagopyrumtataricum：苦荞GABA-T；
XP_023870495.1：欧洲栓皮栎树GABA-T；
XP_021713818.1：藜麦GABA-T；
XP_021275305.1：哥伦比亚锦葵GABA-T；
XP_017980501.1：可可树GABA-T；
XP_012491166.1：雷蒙德氏棉GABA-T；
XP_009349580.1：梨GABA-T；
XP_022771798.1：榴莲GABA-T；
XP_015575910.1：蓖麻GABA-T；
XP_010680154.1：甜菜GABA-T；
XP_021843601.1：菠菜GABA-T)
2.4 发芽苦荞GABA-T基因编码的蛋白质进化树分析
为了解发芽苦荞中GABA-T的进化历程，以及与其他植物GABA-T的亲缘关系，对发芽苦荞GABA-T与藜麦、甜菜等其他多种植物的GABA-T构建系统利用MEG6.06软件进行进化树分析，结果如图3.从进化树分析图可以看出，发芽苦荞GABA-T与甜菜、藜麦和菠菜的GABA-T为同一分支，表明它们基因可能具有相同的起源.
图3 GABA-T基因进化树分析
文中将四川苦荞一号进行发芽处理提取总RNA，利用RT-PCR、巢式PCR和RACE技术扩增成功获得了发芽苦荞GABA-T基因cDNA 3′末端基因，其长度为1 556 bp，包括一个长度为1 347 bp的开放阅读框.序列分析结果表明，其编码一个全长为448个氨基酸的蛋白，且其预测分子量 49.19 kDa，理论等电点(pI)为6.28.同源性分析结果表明，该基因序列与菠菜(Spinaciaoleracea)GABA-T3和蓖麻子(Ricinuscommunis)GABA-T1序列具有较高的相似度(相似度分别为82.79%和80.31%)；
在氨基酸水平上，其与菠菜(Spinaciaoleracea)GABA-T3、欧洲栓皮栎树(Quercussuber)GABA-T3和藜麦(Chenopodiumquinoa)GABA-T3序列相似度分别为87.05%、86.83%和86.16%.进化树分析结果发现，该基因与甜菜、藜麦和菠菜的GABA-T为同一分支，表明它们基因可能具有相同的起源.