高睿骐，赵凤琼，杨莉，龚波
白内障是指由各种病因引起的晶状体混浊，是导致失明的主要原因，患者的视力和生活质量可能会严重受损[1]。目前白内障的标准治疗方法是外科手术，即摘除不透明的晶状体，代之以人工晶体，但仍有许多患者不适用手术。因此，需要开发一种非手术干预方法，预防或延迟白内障的发生。亚硒酸钠白内障模型是研究年龄相关性核性白内障的一种快速、清晰、稳定的啮齿动物模型，可模拟人类白内障的反应[2-3]。因此，亚硒酸钠诱导的白内障动物模型广泛用于医学实验中，以筛选和评估抗白内障药物的治疗潜力。虽然白内障的形成机制尚不完全清楚，但年龄相关性白内障的形成与自由基相关的氧化应激有关[4]。许多研究[5-6]表明，抗氧化剂的补充可以成功预防氧化应激相关的白内障形成。芒果苷（mangiferin）是从芒果的叶子、树皮、果皮和根中提取的天然多酚化合物，现代药理学研究[7]已发现，芒果苷具有多种药理学作用，主要有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等。根据芒果苷具有的优异生物活性，本研究探讨补充芒果苷对亚硒酸钠诱导的大鼠白内障的作用，现报道如下。
1.1 实验动物
40 只新生9 d 龄的Wistar 大鼠购自山东济南朋悦实验动物繁育有限公司[许可证号：SCXK（鲁）2021-0003]。在实验期间，将大鼠饲养于室温下，分别给予光照和黑暗12 h，自由获得食物和水。本研究实验动物及条件符合国家科学技术委员会的《实验动物管理条例》相关规定，由都江堰市人民医院动物实验福利伦理审查委员会获批（伦理审批号：JLZYLL201832）。
1.2 药品、试剂与仪器
芒果苷（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，M114062），亚硒酸钠（美国Sigma 公司，214485），还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，E-EL-0060c、E-EL-0026c），二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒、酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（中国赛默飞世尔科技有限公司，A53225、BMS2279）。
酶标仪（美国Biotek 公司，EON），分光光度计（美国Perkin Elmer 公司，AA-3100），高速冷冻离心机（美国Sigma公司，3K15）。
1.3 建立大鼠亚硒酸钠白内障模型
将30只大鼠以2.46 mg/kg的剂量一次性皮下注射亚硒酸钠构建大鼠白内障模型，另将10只大鼠皮下注射等量0.9%氯化钠注射液。根据晶状体混浊程度判断造模的效果。
1.4 分组与给药
造模成功的大鼠根据随机数字表法随机分为模型组（model group，MG）、芒果苷低剂量组（lowdose mangiferin group，L-MAN）及芒果苷高剂量组（high-dose mangiferin group，H-MAN），每组10 只。另将腹腔注射等量0.9%氯化钠注射液的10 只大鼠设置为对照组（control group，CG）。L-MAN 与HMAN 组大鼠在造模1 h后，进行芒果苷腹腔注射，剂量分别为10 mg/kg 与40 mg/kg，CG、MG 组腹腔注射同体积0.9%氯化钠注射液，连续7 d。21 d 后，检查大鼠白内障的发生情况，并根据其混浊程度进行分级。
1.5 白内障形成评价
用0.5%托吡卡胺滴眼液和2.5%去氧肾上腺素注射液散大瞳孔，由眼科医生确定白内障分级。白内障分为0～6 级[8]，0级为正常透明晶状体；
1级为晶状体后囊膜下或囊膜混浊的初始征象；
2 级为囊膜混浊，后囊膜下纤维肿胀或散在病灶；
3 级为弥漫性囊膜混浊伴皮质散射；
4 级为部分囊膜混浊；
5 级为未累及晶状体皮质的囊膜混浊；
6 级为整个晶状体成熟致密混浊。晶状体混浊评分（0～6 分）为相对应的等级，由2 名对分组不知情的熟练实验操作者进行评价。
1.6 样本采集
麻醉后引颈处死大鼠，迅速摘除眼球，取出晶状体，再次评估各组大鼠晶状体混浊程度，于液氮速冻后放入-80℃冰箱保存备用。
1.7 晶状体总水溶性蛋白浓度测定
使用玻璃匀浆器处理大鼠晶状体，根据试剂盒说明书，使用BCA 蛋白检测试剂盒测定晶状体总水溶性蛋白浓度，酶标仪测定562 nm处吸光度值。
1.8 ELISA法测定大鼠晶状体GSH、MDA水平
取冷冻磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）溶液（PH 7.2）50 mL，称取晶状体匀浆，以1∶10 的比例混合，在4℃12,000 rpm 离心15 min。取上清液，使用MDA 试剂盒，ELISA 法测定MDA、GSH含量，所有操作步骤根据试剂盒说明书进行。
1.9 大鼠晶状体钙离子浓度测定
晶状体样本在100℃加热12 h 后，测量晶状体的干重。在室温下用0.2 mL 的36%浓盐酸消化晶状体过夜，加入去离子水至1.0 mL。在12,000 rpm离心12 min 以除去不溶性物质。用分光光度计测定上清液钙浓度，设置狭缝宽度为0.5 nm，波长为422 nm。使用碳酸钙和去离子水制备标准溶液，浓度根据相应数值进行换算校正。
1.10 统计学方法
采用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析，计量资料数据采用均数±标准差（±s）表示，符合正态分布且方差齐的计量资料，方差分析（ANOVA）进行多组变量间的相互比较，两两比较采用LSD-t检验。当P＜0.05时，被认为差异有统计学意义。
2.1 芒果苷对大鼠白内障形成的影响
CG 组中所有大鼠的晶状体均清晰，MG 组所有大鼠均出现中度至重度白内障，分级为4～6级，提示成功建立了亚硒酸钠白内障大鼠模型；
L-MAN组大鼠有轻度到中度白内障，分级为2～4 级；
H-MAN 组中10 只大鼠中有8 只大鼠晶状体透明。4 组间大鼠晶状体混浊评分比较，差异有统计学意义（F=255.308，P=0.000）。两两比较，与CG 组比较，MG 组晶状体混浊评分升高（t=22.136，P=0.000）；
与MG 组比较，L-MAN、H-MAN 大鼠晶状体混浊评分降低（tL-MAN=4.833，tH-MAN=7.691，均P=0.000），差异均有统计学意义（图1、表1）。
图1 芒果苷对白内障形成的影响
2.2 芒果苷对大鼠晶状体钙离子浓度的影响
4 组间大鼠晶状体钙离子浓度比较，差异有统计学意义（F=187.259，P=0.000）。两两比较，与CG组比较，MG 组大鼠晶状体钙离子浓度升高（t=22.046，P=0.000）；
与MG 组比较，L-MAN、H-MAN组大鼠晶状体钙离子浓度降低（tL-MAN=13.706，tH-MAN=16.982，均P=0.000），差异均有统计学意义（表1）。
2.3 芒果苷对大鼠晶状体总水溶性蛋白的影响
4 组间大鼠晶状体总水溶性蛋白水平比较，差异有统计学意义（F=47.838，P=0.000）。两两比较，与CG 组比较，MG 组的大鼠晶状体总水溶性蛋白水平降低（t=8.741，P=0.000）；
MG 组比较，L-MAN、HMAN 组大鼠晶状体总水溶性蛋白水平升高（tL-MAN=3.061，P=0.007；
tH-MAN=9.742，P=0.000），差异均有统计学意义（表1）。
表1 芒果苷对大鼠晶状体白内障的影响（±s，n=10）
表1 芒果苷对大鼠晶状体白内障的影响（±s，n=10）
注：#与CG 组比较，P＜0.05；
*与MG 组比较，P＜0.05；
CG 对照组；
MG 模型组；
L-MAN 芒果苷低剂量组；
L-MAN 芒果苷高剂量组；
MDA 丙二醛；
GSH 还原型谷胱甘肽
2.4 芒果苷对大鼠晶状体氧化应激的影响
4组间大鼠晶状体MDA、GSH水平比较，差异有统计学意义（FMDA=593.824，FGSH=271.496，均P=0.000）。两两比较，与CG组比较，MG组大鼠晶状体MDA 水平升高（t=31.917，P=0.000），GSH 水平降低（t=27.540，P=0.000）；
与MG 组比较，L-MAN、HMAN 组大鼠晶状体MDA 水平降低（tL-MAN=11.988，tH-MAN=20.427，均P=0.000），GSH 升高（tL-MAN=9.229，tH-MAN=33.772，均P=0.000），差异均有统计学意义（表1）。
白内障是一种由各种病因引起的晶状体混浊，是导致失明的主要原因。亚硒酸钠白内障模型是模拟年龄相关性核性白内障最常用的动物模型[2-3]。本实验的结果显示，向出生9 d 的大鼠一次性皮下注射过量的亚硒酸钠，在出生第30 d 观察到MG 组大鼠出现严重的双侧核性白内障，而给予芒果苷治疗的大鼠白内障程度得到了不同程度的改善。
钙稳态对晶状体的维持透明度至关重要[9]。钙离子-腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）酶被认为在晶状体钙稳态中发挥核心作用，使钙水平保持在亚微摩尔范围内，而在白内障形成中晶状体钙稳态发生了改变[10]。在本研究可以观察到，CG 组钙离子含量极低，而MG 组的晶状体钙离子含量增高，与上述观点相符。在使用芒果苷治疗组中，大鼠晶状体中钙离子水平下降，结合形态学检查结果，推测芒果苷可能通过降低钙离子水平，抑制白内障形成。
晶状体蛋白是保持晶状体透明的基础，根据溶解性不同，可分为水溶性、不溶性蛋白，其中水溶性蛋白约占90%。水溶性蛋白分子包括α、β、γ的3种类型，分子结构都含有数目不等的巯基，易被氧化成不溶性蛋白质，形成非均匀介质的增多。晶状体中水溶性蛋白减少，不溶性晶状体蛋白增加，使晶体透光性、折射能力受到影响，是白内障发病的物质基础[11]。本研究结果中，使用强氧化剂亚硒酸钠，观察到MG 组的晶状体总水溶性蛋白减少，结合形态学检查中观察到的不溶性蛋白增加，表明结果与前述观点保持一致。而使用芒果苷治疗后，晶状体总水溶性蛋白增加，推测芒果苷可能通过抑制亚硒酸钠导致的水溶性蛋白的减少，达到改善白内障的效果。
年龄相关性白内障的形成与自由基相关的氧化应激有关[4]。健康的晶状体含有GSH，GSH 通过直接清除活性氧（reactive oxygen species，ROS）来维持蛋白质巯基的主要因子，保护细胞成分免受氧化应激损伤。而老化的晶状体GSH 减少，抗氧化活性能力下降，ROS 水平升高，过量的自由基作用于脂质发生过氧化反应，氧化终产物为MDA，引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，导致晶状体混浊，最终形成白内障[12-13]。本研究结果显示，亚硒酸钠诱导形成的大鼠白内障晶状体中，MDA 水平升高，GSH 减少，与SUN Y 等[4]的结果一致，表明白内障的形成与氧化应激相关。研究[7]表明，芒果苷具有抗氧化应激等多种药理学作用。DING L 等[14]的研究结果证明，芒果苷通过激活骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein2，BMP2）/Smad核相互作用蛋白（Smad nuclear interacting protein1，SNIP1）信号通路来保护MC3T3-E1细胞免受右旋美托咪啶（dexmedetomidine，Dex）诱导的细胞凋亡和氧化应激。HUANG J 等[15]的研究表明，芒果苷改善了子痫前期小鼠的胎盘氧化应激并激活磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路。本实验结果显示，使用芒果苷治疗后，大鼠晶状体中GSH 水平增加，MDA 水平下降。亚硒酸钠加速了晶状体GSH 的消耗，进而增加了晶状体损伤，表现为是脂质过氧化速率的增加[16]。而芒果苷抑制了由亚硒酸钠引起的GSH 消耗以及MDA 产生。这些结果表明，芒果苷减少亚硒酸钠诱导的氧化应激，从而减少晶状体总水溶性蛋白的氧化，改善白内障的形成。
综上所述，本研究发现了芒果苷对亚硒酸钠所致的大鼠白内障具有一定的治疗作用，其机制可能是通过维持钙稳态、抑制亚硒酸钠导致的氧化应激对水溶性蛋白的氧化，减少不溶性蛋白的生成，从而实现改善大鼠白内障的疗效，本研究可为白内障治疗提供新思路。
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