血小板功能检测在血栓性疾病诊断中的研究进展

张帆 闫本纯 李琪 路瑶 李晨 李春燕 马思琦 闫海润

血栓性疾病包括静脉血栓性疾病及动脉血栓性疾病，严重损害人体健康，其是凝血和纤溶系统功能失调，以及凝血- 抗凝系统不平衡所致[1]。而血小板在原发性止血和血栓形成过程中起着关键作用，监测其异常活化对了解血栓的发生、发展至关重要。既往一些实验室指标，如D-二聚体（D-Dimer，DD）、纤维蛋白原降解产物（Fibrin degradation products，FDP）等对血栓性疾病的预测与评估已得到了较好的应用。随着对血小板功能了解的不断深入，通过对其部分检验指标如膜蛋白、血小板微粒、血小板释放活性物质、外泌体、特异性血小板标志物等的检测，对血栓性疾病的分型、诊断、机制等研究有了更具针对性的观点。随着检测手段的不断提高，血小板功能检测出现许多新方法，为血栓性疾病早期诊断、治疗、监测及机制的研究提供准确的实验依据。现对近年来血小板功能检测在血栓性疾病诊断中的研究进展进行综述，并介绍一些诊断血栓性疾病的方法学应用。

静脉血栓栓塞症（Venous thromboembolism，VTE），包括深静脉血栓栓塞（Deep venous thrombosis，DVT）和肺血栓栓塞（Pulmonary thromboembolism，PTE）[2]。在静脉血栓形成过程中，其机制主要包括局部炎症反应和血液高凝状态两个方面。局部炎症以内皮细胞活化为特征，内皮细胞活化后释放Webel-palade小体，并含有血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）以及与膜结合的P 选择素。这两种蛋白都可与血管内皮细胞表面发生黏附，分别通过与白细胞表面的P 选择素糖蛋白配体1（PSG-1）和整合素αMβ2结合而激活白细胞。局部炎症与血栓相互促进，加速静脉血栓形成[3]。血小板功能中的血小板微粒、P 选择素、硫醇异构酶等指标对VTE具有潜在的预测能力。

1.1 血小板微粒微粒最初被认为与血栓性疾病有关是因其表面具有促凝作用的磷脂，尤其是磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS），增加了凝血因子Ⅷ与凝血因子Ⅸ、凝血因子V 与凝血因子Ⅹ结合的亲和性，因此使因子凝血酶原酶复合物与X 酶复合物的生成效率更高[4]。在血液循环中，大部分微粒是由血小板产生的，也就是血小板微粒（Platelet microparticle，PMP）。PMP 水平增高表明患者处于高凝状态，有较高的VTE 风险。另外，研究显示，心房颤动患者发生血栓风险是窦性心律患者的4～5倍[5，6]。Siwaponanan 等[7]研究发现，房颤患者总循环微粒水平显著增加，其中以血小板源性微粒及内皮源性微粒增加尤为显著。Mavroudis 等[8]检测了将要进行冠状动脉介入治疗的急性冠状动脉综合征（Acute coronary syndrome，ACS）患者冠状动脉和右心房处的微粒含量，结果显示，病变部位的冠状动脉微粒含量相对于右心房处较高。与CT、MRI等影像学检查相比，冠心病等心脑血管疾病中PMP的变化会出现的更早[9]。因此，PMP 可以被认为是预测血栓性疾病的敏感指标，是出现明显临床症状前的特异性生物标志物，对疾病的病情监测、诊疗及转归评估具有重要作用。

1.2 P 选择素P 选择素具有显著提高血管通透性的能力，刺激病变区域的炎症反应，并使血管痉挛明显增加，血小板水平逐渐升高[10]。血小板膜糖蛋白GPIba 受体、P 选择素与早期炎症细胞发生协同反应，从而使白细胞的聚集加速。例如，白细胞整合素αMβ2 通过GPIb a 受体来调节血栓形成和DVT 的发展[11]。Mosevoll 等[12]评估43 种潜在的深静脉血栓生物标志物，发现P 选择素是对深静脉血栓诊断良好的潜在生物标志物之一。P 选择素高水平表达时可增加血栓形成的发生率，P 选择素是DVT 的危险因素，可作为预测DVT 的检测指标[13]。林毅秋等[14]对创伤性骨折深静脉血栓形成的研究发现，P 选择素会显著升高。因此，P 选择素作为血小板的特异性活化指标，通过检测其水平可分析其与患者血栓形成风险及血栓病情演变的关系，提高对血栓栓塞风险预测及病情评估的能力。

1.3 蛋白质二硫键异构酶蛋白质二硫键异构酶（Protein disulfide isomerase，PDI）是一种在蛋白质合成中促进二硫键氧化、还原和异构化作用的细胞内酶[15]。从血小板和内皮细胞分泌的PDI 是所有血栓形成事件的重要因子[16]。因此，PDI 的血浆水平也可作为血栓性疾病的潜在生物标志物。血小板表面PDI 有望成为一种血栓治疗的靶点。

VTE 的实验诊断尚未达成一致，随着对血栓性疾病的了解和检验技术的改进，通过为临床提供早期、快速、经济、高效的实验室检测手段，检测血小板功能中的特异性生物标志物可指导临床对高危人群早期明确诊断，监测治疗效果，降低患者死亡率，提高患者生存质量。

动脉血栓是致命性心脑血管事件的一种重要病理变化，早期发现血栓是降低死亡率的关键因素，但目前尚无有效的早期预警手段，凝血筛查暂且只应用于低风险人群，无法准确评判血栓风险、血栓形成以及由各种因素引起的血液高凝状态[17]。ACS 是以冠状动脉粥样硬化斑块破裂或侵袭，继发血栓形成的一组临床综合征。在ACS 的发生发展中，微粒的促凝活性会起到促进作用[18]。研究发现，动脉粥样硬化的发生、血栓形成和血管痉挛是急性缺血性脑卒中（Artery ischemic stroke，AIS）发病的重要病理机制，血管受损、斑块破裂、血流动力学紊乱引起血小板的活化，是AIS 发病的重要原因[19]。

2.1 基质金属蛋白酶血小板包含并释放多种基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs），MMPs是一类具有特定降解能力的锌依赖性蛋白水解酶。MMPs 参与血管重塑、斑块破裂、血栓形成等，并且有可能导致急性冠心病，如心肌梗死。MMP-2 和MMP-9 在血管病变中的表达增高[20，21]。MMPs 和肌钙蛋白等标志物可共同用于ACS 的早期诊断检测研究[21]。所以，检测MMPs 和肌钙蛋白水平对心血管疾病早期诊断具有重要意义，可加强临床评估，并进一步减少对诊断成像研究的需求。

2.2 外泌体外泌体是由细胞分泌的一种膜囊泡，包含蛋白质、脂质和microRNA 等[22，23]。相较于其他血液成分，血小板分泌外泌体的量最多，内容物种类也最为丰富[24]。血小板不仅是血栓的组成成分，也可以通过分泌外泌体来抑制血栓的形成。Srikanthan 等[25]研究显示，在血栓形成之初，血小板分泌外泌体携带的泛素化蛋白（Poly-ubiquitin）可泛素化降解巨噬细胞中CD36 蛋白，抑制巨噬细胞的载脂过程，并通过泛素化血小板表面CD36 蛋白抑制血小板自身的再活化和动脉血栓形成。因此，外泌体作为一种可预测血栓的血液诊断标记物，可对血栓性疾病提供辅助性诊断。

2.3 特异性血小板标志物CD62p 和CD63 是最有特异性意义的血小板活化分子标志物。CD63 通过与中性粒细胞接触，递送活化信息，从而使中性粒细胞变形、趋化、黏附，导致局部缺血病变的血管发炎，从而加剧局部组织缺血。CD63 在预测脑卒中事件和抗血小板治疗方面有一定的作用。循环CD62p 在各种缺血性脑卒中患者中也有明显升高。CD62p 在急性脑梗死中的表达水平可以评判病变区域血小板活化情况，对其病情及预后的判断具有重要意义[26～28]。研究显示[29]，AIS 患者CD62p 和CD63 的异常表达与AIS 的发生、严重程度等有关，CD62p、CD63 的动态变化特点对于确定最佳监测点具有重要价值。

通过检测血小板的各项特异性指标，对动脉血栓性疾病进行早期预警、早期诊断、病情监测和针对性治疗，在提高患者生存率、改善远期预后及降低疾病致死率、致残率方面具有重要价值。

3.1 常用血小板功能检测方法

3.1.1 光学比浊法（Light transmission aggregometry，LTA）LTA 作为一种检测血小板聚集功能的方法，至今仍被视为检测血小板功能的金标准。检测原理：将血液通过离心方法分离出富含血小板血浆（PRP），在特定的连续搅拌条件下，加入诱导剂，随着血小板聚集率增高，其透光度增加，用比浊仪检测透光度的变化来评估血小板的聚集功能。其优点为操作简单，应用广泛；
缺点为步骤较多，影响因素较多，需要规范的操作规程。

3.1.2 血栓弹力图（Thromboelastography，TEG） TEG利用全血直接对血小板聚集功能进行检测。检测原理：模拟人体内环境下凝血-纤溶整个过程，联合应用血流剪切力与不同诱导剂评价血块形成。其优点为操作简便，反映直观的凝血过程；
缺点为与LTA 法检测结果的相关性上仍有争议，价格昂贵，存在一定局限性。

3.1.3 快速血小板功能分析仪（VerifyNow） VerifyNow是目前欧美国家应用较多的血小板功能检测方法。检测原理：在抗纤维蛋白原包被颗粒介导下血小板聚集，在比浊法下，展示出透光性。其优点为用血量少，可床旁检测，操作简便；
缺点为仪器试剂昂贵，成本高。

3.1.4 电阻抗法（Impedance platelet aggregometry，IPA）IPA 原理为血样本中加入诱导剂使血小板活化，随着血小板聚集率增高，全血电阻增高。其优点在于使用全血样本，所需血样少，操作简便；
缺点为耗时长，检测结果受红细胞比容和血小板计数影响。

3.1.5 血小板功能分析仪 通过计量全血在剪切流动下形成血小板栓子的时间，来反映血小板的黏附聚集功能。其优点在于检测标准化的体外出血时间，可应用于严重血小板功能异常评价；
缺点为缺乏公认的参考范围和疗效评估标准，标准化差[30]。

3.2 基因测序高通量测序（High-throughput sequencing，HTS）技术即第二代测序技术，通过构建一个文库，将文库与载体进行交联扩增，在载体上进行基因的合成与测序，以获得DNA 序列数据[31]。当抗凝蛋白基因出现功能缺失性突变时，会促进血栓发生。凝血因子的功能获得性突变，会使血液凝固程度升高，导致血栓的形成。研究发现一例静脉血栓患者FⅨ基因1151G/A 突变导致FⅨ氨基酸替换，即FⅨArg384Gln FⅨR384Q（含信号肽编码）或FⅨR338Q（经典编码）[32]。祁亚楠等[33]研究显示，α-纤维蛋白原rs6050（Thr312Ala）基因位点携带C 等位基因的人群，更容易出现VTE。因此，C 等位基因检测作为对VTE 高危人群的筛查是一种行之有效的手段，可以为VTE 的预防、诊断和治疗提供参考。以上研究结果表明，基因检测技术扩展了对血小板疾病的认识，具有很好的临床应用效果，为未来的精准化基因治疗奠定了基础，值得在临床上推广。其不仅大大提高了疾病的诊治水平，也为深入探讨疾病的发病机制提供一个新方向。

3.3 人工智能近年来，研究表明人工智能（Artificial intelligence，AI）具有良好的诊断和预测静脉血栓形成的能力，具有高灵敏度、特异性和ROC 曲线下面积值。基于AI 的VTE 质量控制系统实现了自动化、动态的过程防治模式，用新技术评估患者的风险，以增强预防意识，增加高危患者的预防比例，降低院内VTE 的发病率。随着AI 在静脉血栓研究领域的发展和应用，未来可以进行更深入、更准确的分析，从而开发出适用性强、便捷的AI 模型，在临床实践中广泛应用[34，35]。

血小板是血栓性疾病形成过程中的重要组成部分，其过度活化加速了血栓性疾病的进程。目前，临床上常用DD 作为预测指标，但其特异性较差。通过对血小板功能的各项特异性标志物进行检测，在出现明显临床症状之前，进行风险预测、早期诊断、及时干预，对于提高患者的生存率和改善预后非常重要。常规的血小板测定方法有通过LTA 和TEG 检测血小板聚集功能；
血小板功能分析仪在剪应力下检测血小板黏附聚集功能；
流式细胞术测定血小板表面的抗原以测定血小板活化状态等。常规血小板功能检测有各自的优势与不足，国内研制血小板功能快检技术方面尚属空白，一些血栓性疾病的实验室检测尚不具备金标准，对血栓性疾病的诊断有所滞后。血小板功能检测对血栓性疾病的重要价值还有待进一步得到重视，逐步开展实验室检测项目应用于临床。

近年来，基因测序作为一种重要的分子生物学技术，已在血栓与止血领域得到应用。检测血栓性疾病的相关基因具有较好的筛选价值，也是临床诊疗的重要手段。基因测序作为一种精准的检测方法，使疾病的早期诊断有了更加可靠的依据，虽然目前尚未广泛应用于临床，却是未来精准医疗的大势所趋。AI 作为新兴科技力量，具有良好的应用效能，有望在临床大规模应用。

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