曾允灏，苏 文，2，郑小莉，王景华，陈德经，2
（1.陕西理工大学 生物科学与工程学院，陕西 汉中 723001；
2.陕西理工大学 陕西省资源生物重点实验室，陕西 汉中 723001；
3.汉中市科技资源统筹中心，陕西 汉中 723001）
我国具有传统深厚的酒文化，酒在生活中成为不可缺少的饮品。乙醇进入机体后，10%由肾脏和肺排出，90%在肝脏内进行代谢和分解[1]，在肝脏中由乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）氧化为乙醛，乙醛经乙醛脱氢酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）氧化为乙酸进入三羧酸循环，最终代谢为二氧化碳和水[2]。饮酒过量会产生酒精中毒，长期嗜酒会形成酒精依赖症[3]，长期饮酒诱发肝硬化以及肝癌[4]，还会引起肥胖、高血脂症、动脉硬化等[5]。世界卫生组织指出，酒精性肝损伤已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝脏疾病[6]。如何降低饮酒对肝脏的损伤成为当前研究的热点问题。研究表明，生物小分子肽具有较高的抗氧化、抗肿瘤、抗衰老活性、易吸收[7]，促进乙醇脱氢酶及乙醛脱氢酶活性，能加快酒精代谢速率，减少代谢产物对肝组织的损害作用[8]。LI G M等[9]研究发现，玉米肽具有抗氧化、抗高血压、保肝、促进酒精代谢等功能；
陈頔等[10]用鱼皮低聚肽灌胃酒精性肝损伤小鼠，发现鱼皮低聚肽对酒精性肝损伤小鼠具有保护作用。
大鲵（Andrias davidianus）属大型两栖纲、有尾目、隐鳃鲵科，在地球上有3.5亿年生活史，具有极强的耐饥能力和抗逆境能力[11]。大鲵肝脏占体质量的3%～5%，是大鲵加工的主要副产物[12]。大鲵肝脏具有较高营养价值，含有丰富的蛋白质和酶[13]，富含不饱和脂肪酸[14]，但大鲵肝脏腥味重，难以加以利用，多作为废弃物直接丢弃，将肝脏制备小分子肽，提高大鲵附加值[15]。近年来，将多肽与酒结合制备多肽保健酒是多肽利用的重要途径，关于多肽酒的研究报道越来越多，如植物源的多肽酒：山药肽酒[16]、柠檬肽酒[17]，蚕豆肽酒[18]等；
动物物源多肽酒：海参肽酒[19]、甲鱼肽酒[20]、鹿茸血肽酒[21]、大鲵肽酒[22]、牡蛎肽酒[23]等，但是以大鲵肝肽（giant salamander liver peptide，GSLP）制备的大鲵肝肽酒研究较少。
本研究以大鲵肝脏与白酒为原料制备大鲵肝肽酒，通过酶解法制备肝肽，对其体外乙醇脱氢酶（ADH）激活活性、体外抗氧化活性和溶解度进行测定，并测定大鲵肝肽酒对小鼠肝脏乙醇脱氢酶（ADH）和乙醛脱氢酶（ALDH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力与还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）、甘油三酯（triglyceride，TG）含量及血清中谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活性的影响，以期探讨大鲵肝肽酒对酒后小鼠的肝脏保护作用，为大鲵肝脏高值化利用和多肽酒的开发提供理论依据。
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
大鲵肝脏：陕西鲵生元科技有限公司；
53%vol酱香型白酒：贵州茅台酒厂保健酒业有限公司；
无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级雄性昆明种小鼠：4周龄，体质量（22±2）g，实验动物使用许可证号SCXK（陕）2018-001，由西安交通大学医学院部实验动物中心提供，饲养条件为温度（22±2）℃，湿度50%～60%，昼夜交替。
1.1.2 试剂
风味蛋白酶（酶活40000U/g）、胰蛋白酶（酶活4000U/g）：广西南宁庞博生物工程有限公司；
碳酸氢钠、柠檬酸：天津市富宇精细化工有限公司；
乙醇脱氢酶（ADH）（1.0 U/mL）：美国Sigma公司；
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷：上海源叶生物科技有限公司；
硫酸亚铁、水杨酸：天津市北联精细化学品开发有限公司；
铁氰化钾：成都市科龙化学试剂厂；
三氯乙酸：上海精析化工科技有限公司；
三氯化铁：天津市福晨化学试剂厂；
维生素C（vitamin C，VC）：成都市科龙化工试剂厂；
二喹林甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法微量蛋白定量试剂盒、血乙醇（blood ethanol，ALC）试剂盒、谷丙转氨酶（ALT）试剂盒、谷草转氨酶（AST）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、还原型谷胱甘肽（GSH）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、甘油三酯（TG）试剂盒、乙醇脱氢酶（ADH）试剂盒、乙醛脱氢酶（ALDH）试剂盒：南京建成生物工程研究所。本研究所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
DK-98-Ⅱ恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；
TGL-20M冷冻离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司；
LC-800低速台式离机：科大创新股份有限公司中佳分公司；
Xinyi-100F真空冷冻干燥机：宁波新艺超声设备有限公司；
Epoch 2酶标仪：美国BioTek公司；
UV-1750紫外-可见分光光度计：日本岛津仪器公司；
PE28型pH计：梅特勒-托利多仪器有限公司；
陶瓷膜过滤机、纳滤膜过滤机及超滤膜（截留分子质量3 000 Da）：南京艾宇琦膜科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 大鲵肝肽酒的加工工艺流程及操作要点
操作要点：
原料预处理：流水清洗大鲵肝脏，按料液比1∶5（g∶mL）添加0.9%生理盐水浸泡30 min，1%酵母发酵液（按大鲵肝脏质量1%酵母粉和2%白砂糖在37 ℃活化1 h）浸泡30 min，清洗沥干，绞碎制成肝糜。
酶解：在肝糜中加入1%的风味蛋白酶，以肝糜和蒸馏水的料液比为1∶1（g∶mL）添加蒸馏水、于pH 7.0、53 ℃条件下搅拌酶解4 h；
再添加0.5%胰蛋白酶，于pH 8.0、37 ℃条件下酶解3 h；
灭酶活（95 ℃、10 min）。
离心、脱色脱腥：酶解液离心（5 500 r/min、15 min），去除上清液中油脂及沉淀，收集上清液。在上清液中加入1%活性炭，50 ℃、0.08 Pa下抽真空，搅拌脱色脱腥1 h。
过滤、超滤：用过压滤机脱活性炭后陶瓷膜过滤，得到分子质量＜10 000 Da多肽的酶解液。用截留分子质量3 000 Da的超滤膜对其进行超滤分级分离，得到3种不同分子质量段的多肽液。
冷冻干燥：在温度-50～20 ℃、真空度13～40 Pa条件下，经冷冻干燥后制得大鲵肝肽粉：GSLP-Ⅰ（分子质量＞10 000 Da）、GSLP-Ⅱ（分子质量3 000～10 000 Da）、GSLP-Ⅲ（分子质量＜3 000 Da）。
调配：于1%大鲵肝肽粉中，按料液比1∶100（g∶mL）添加53%vol酱香型白酒，即得大鲵肝肽酒。
1.3.2 不同分子质量大鲵肝肽体外ADH激活活性
大鲵肝肽ADH激活率参考刘鹏[24]的方法进行测定，其计算公式如下：
式中：A1为样品反应初始的OD340nm值；
A2为样品反应结束的OD340nm值。
1.3.3 不同分子质量大鲵肝肽体外抗氧化活性测定
DPPH自由基（DPPH·）清除率的测定[25]：将不同分子质量肝肽加蒸馏水溶解，配制样品质量浓度为10.0 mg/mL。取3 mL样品溶液于试管中，加入3 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液，振荡混匀后避光放置30 min，在波长517 nm处测吸光度值，用蒸馏水调零，抗坏血酸溶液（0.5 mg/mL）作阳性对照。平行测定吸光度值3次。DPPH·清除率计算公式如下：
式中：A0为蒸馏水-DPPH溶液的吸光度值；
A1为样品-DPPH溶液的吸光度值；
A2为样品-乙醇溶液的吸光度值。
羟自由基（·OH）清除率的测定[26]：将不同分子质量肝肽加蒸馏水溶解，配制样品质量浓度为10.0mg/mL。取2mL样品溶液于试管中，加2 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、2 mL 9 mmol/L水杨酸乙醇溶液，再加2 mL 9 mmol/L H2O2溶液，于37 ℃水浴条件下加热30 min，待冷却后离心。以蒸馏水作为空白对照，抗坏血酸溶液（0.5 mg/mL）作阳性对照。在波长510 nm处测定吸光度值，实验重复3次，·OH的清除率计算公式如下：
式中：A0为蒸馏水-水杨酸乙醇吸光度值；
A1为样品-水杨酸乙醇溶液吸光度值；
A2为加入样品溶液但不加水杨酸乙醇溶液吸光度值。
超氧阴离子自由基（O-2·）清除率测定[27]：采用邻苯三酚自氧化法测定，将不同分子质量肝肽加蒸馏水溶解，配制样品质量浓度为10.0 mg/mL。取1 mL样品溶液于试管中，各加入4.5 mL 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液和0.1 mL 3 mmol/L邻苯三酚溶液充分混匀，于25 ℃水浴反应10 min，加入1 mL 8 mmol/L HCl溶液终止反应。在波长320 nm处测定吸光度值，以蒸馏水作为空白对照，抗坏血酸溶液（0.5 mg/mL）作为阳性对照。实验重复3次，O-2·清除率计算公式如下：
式中：A0为不加样品溶液，加邻苯三酚溶液的吸光度值；
A1为加样品溶液和邻苯三酚溶液的吸光度值；
A2为加样品溶液但不加邻苯三酚溶液的吸光度值。
总还原力的测定[28]：将不同分子量肝肽加蒸馏水溶解，配制样品质量浓度为10.0 mg/mL。取样品溶液2 mL，加入2 mL 0.2 mol/L pH 6.6磷酸盐缓冲液和2 mL 1%铁氰化钾溶液充分混匀后，于50 ℃水浴条件下静置20 min后，加入10%三氯乙酸2 mL，充分混合，4 000 r/min离心10 min，取2.5 mL上清液，再加入2 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%三氯化铁后混匀，室温条件下静置10 min，在波长700 nm处测定吸光度值，实验重复3次，以蒸馏水作为空白对照，抗坏血酸溶液（0.5 mg/mL）作为阳性对照。
1.3.4 不同分子质量大鲵肝肽溶解度的测定
称取0.250 0 g 3个不同分子质量大鲵肝肽粉置入50 mL于离心管中，再分别加入酒精度为12%vol、35%vol、45%vol、53%vol的酱香型白酒25 mL摇匀，室温静置7 d后4 000 r/min离心15 min，上清液倒入坩锅置于105 ℃烘箱，烘至恒质量[29]，计算溶解度，其计算公式如下：
式中：m为坩锅的质量，g；
M为坩锅和溶解肽粉的质量，g；
w为肽粉的质量，g。
1.3.5 大鲵肝肽酒的动物实验
遵循实验动物伦理规程和标准，取昆明种雄性小鼠45只，经7 d适应期，按随机数字标法分3组，即空白对照组、白酒组、大鲵肝肽酒组，每组15只。空白对照组小鼠每日灌胃生理盐水（0.12 mL/10 g体质量），白酒组小鼠每日灌胃53%vol酱香型白酒（0.12 mL/10 g体质量）[30]，大鲵肝肽酒组小鼠每日灌胃最适条件制备的大鲵肝肽酒（0.12 mL/10 g体质量），连续灌胃10 d。
1.3.6 样品的采集及处理
末次灌胃2 h后从每个实验组中各取3只小鼠，眼球取血（4 ℃、3 000 r/min离心15 min，取上层血清保存于-80 ℃冰箱中），解剖小鼠取肝脏，在4 ℃的生理盐水中反复冲洗，滤纸吸干后称取肝脏质量，剪取一部分肝组织，用10%甲醛溶液固定；
剩余肝组织-80 ℃冰箱保存，其他小鼠用于血液和肝脏的生化指标检测。在实验期间，每日固定时间对小鼠灌胃前进行称量并记录，及时调整给酒灌胃体积，观察小鼠有无死亡、精神状态、活动能力等。
1.3.7 生化指标的测定
（1）血液乙醇含量
根据血乙醇试剂盒的说明书测定小鼠血液乙醇含量。
（2）肝脏生化指标
以9倍肝组织体积加入预冷生理盐水，冰浴条件下匀浆制成10%肝组织匀浆，离心（3 000 r/min、4 ℃、20 min），取上清液，按照试剂盒的说明书测定小鼠肝脏SOD活力、GSH、MDA、TG含量，以及乙醇代谢相关酶ADH、ALDH活力。
（3）血清生化指标
根据试剂盒的说明书测定小鼠血清的谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）活力。
1.3.8 数据分析
采用OriginPro 2018软件进行绘图，SPSS 20.0软件进行数据统计分析，P＜0.05，表示差异显著。
2.1 不同分子质量肝肽对ADH激活率的影响
ADH是一种含锌金属蛋白酶，主要存在于肝脏，是酒精代谢最主要的参与酶和代谢酶，不同分子质量的多肽对ADH激活率不同[31]。不同分子质量肝肽对体外ADH的激活作用见图1。
图1 不同分子质量肝肽对体外乙醇脱氢酶的激活作用Fig.1 Activation of liver peptides with different molecular mass on alcohol dehydrogenase in vitro
由图1可知，在相同质量浓度下，不同分子质量的肝肽对体外ADH激活作用具有显著性差异（P＜0.05），对ADH激活率从大到小排序为：GSLP-Ⅲ＞GSLP-Ⅰ＞GSLP-Ⅱ，其中，GSLP-Ⅲ对ADH激活率最高，达83.53%，GSLP-Ⅰ激活率为73.47%，GSLP-Ⅱ激活率最低，为61.53%。结果表明，大鲵肝肽对体外ADH的激活作用并不受分子质量大小的影响，这与张帅[32]的研究结果一致。
2.2 不同分子质量肝肽体外抗氧化活性测定
不同分子质量肝肽的体外抗氧化活性测定结果见表1。
表1 不同分子质量肝肽体外抗氧化活性Table 1 Antioxidant activity in vitro of liver peptides with different molecular mass
由表1可知，VC的抗氧化能力最强，不同分子质量肝肽对DPPH·、·OH和均具有较强清除能力，按抗氧化能力大小对肝肽样品排序为：GSLP-Ⅲ＞GSLP-Ⅱ＞GSLP-Ⅰ。其中，GSLP-Ⅲ肝肽对DPPH·、·OH和清除率均达到了83.50%以上，显著高于其他肝肽组分；
GSLP-Ⅲ肝肽还原力显著高于其他肝肽组分（P＜0.05）。在相同质量浓度下，肝肽分子质量越小，体外抗氧化能力越强，这是因为疏水性氨基酸和芳香族氨基酸含量增加，具有抗氧化性的氨基酸增加[33]。
2.3 大鲵肝肽的溶解度
不同分子质量肝肽在不同酒精度白酒中的溶解度见表2。
表2 不同分子质量肝肽在不同酒精度白酒中的溶解度Table 2 Solubility of liver peptides with different molecular mass in Baijiu with different alcohol content%
由表2可知，不同分子质量肝肽在不同酒精度白酒中的溶解度不同，在同一分子质量肝肽条件下，随着酒精度的增加，溶解度逐渐降低。在同一酒精度的条件下，分子质量小的肝肽在白酒中的溶解度显著高于分子质量大的肝肽（P＜0.05）。GSLP-Ⅲ肝肽在12%vol～53%vol酒精中溶解度均＞94.00%。不同分子质量肝肽，在不同酒精度中溶解度不同，究其原因可能是，肽的分子质量大小、肽的结构及端基极性基团决定了肽在酒中的溶解度[34]。
2.4 大鲵肝肽酒对小鼠血液乙醇含量及肝脏代谢酶活性的影响
饮酒后，大部分的酒精经胃肠道进入血液，使血液中乙醇含量升高，在60 min左右达到最高[35]，最终进入肝脏进行分解代谢，酒精分解代谢与肝脏中的乙醇脱氢酶（ADH）和乙醛脱氢酶（ALDH）的活力有密切关系。小鼠饮酒后2 h血乙醇含量及肝脏中的乙醇脱氢酶（ADH）和乙醛脱氢酶（ALDH）的活性见表3。
表3 大鲵肝肽酒对小鼠血乙醇含量及肝脏代谢酶活性的影响Table 3 Effect of Andrias davidianus liver peptide wine on ethanol concentration of blood and metabolic enzyme activity of mouse liver
由表3可知，与空白对照组相比，白酒组、肝肽酒组的ADH活性分别降低55.77%、26.33%，ALDH活性分别降低25.33%、5.29%，白酒组、肝肽酒组ADH活力显著低于空白对照组（P＜0.05），肝肽酒组ALDH活力与空白组无显著差异（P＞0.05）；
与白酒组相比，肝肽酒组的ADH和ALDH活性分别显著升高66.58%、26.84%（P＜0.05），血液乙醇含量显著降低14.29%（P＜0.05），说明大鲵肝肽酒在一定程度上具有激活ADH和ALDH的活性，可以加速酒精代谢，降低血乙醇含量。
2.5 大鲵肝肽酒对小鼠肝脏氧化应激代谢酶活性的影响
氧化应激是体内氧化与抗氧化作用失衡，是由自由基在体内产生的一种负面作用。长期大量饮酒后，酒精在肝组织代谢会超过肝脏的正常生理代谢能力，使肝组织发生脂质过氧化，降低谷胱甘肽（GSH）含量和超氧化物歧化酶（SOD）酶活，增加丙二醛（MDA）和甘油三脂（TG）含量[36]。大鲵肝肽酒对小鼠肝脏氧化应激谢酶活性的影响见表4。
表4 大鲵肝肽酒对小鼠肝脏氧化应激代谢酶活性的影响Table 4 Effect of Andrias davidianus liver peptide wine on oxidative stress metabolic enzyme activity of mouse liver
由表4可知，与空白组相比，白酒组、肝肽酒组的SOD活性分别显著降低30.78%、19.82%（P＜0.05），GSH含量分别显著降低47.58%、28.23%，MDA含量分别显著升高76.03%、45.45%（P＜0.05），TG含量分别显著升高140.00%、76.67%（P＜0.05）。与白酒组相比，肝肽酒组的SOD活力和GSH含量分别显著升高15.84%、36.92%（P＜0.05），MDA、TG含量分别显著降低17.37%、26.39%（P＜0.05），说明大鲵肝肽酒在一定程度上可提高小鼠肝脏SOD活力和GSH含量，降低脂质过氧化物MDA和TG含量，减轻肝脏的氧化应激反应。
2.6 大鲵肝肽酒对小鼠血清转氨酶指标的影响
谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）是评价肝受损的重要指标[37]，肝细胞发生异常时，可引起炎症反应和肝细胞坏死，细胞膜的通透性增加，使肝细胞ALT和AST进入血液。大鲵肝肽酒对小鼠血清ALT和AST活性的影响见图2。
由图2可知，与空白对照组相比，白酒组、肝肽酒组小鼠血清中ALT活性分别显著升高了107.33%、62.09%（P＜0.05），AST活性分别显著升高108.46%、58.24%（P＜0.05），白酒组和肝肽酒组小鼠血清中ALT和AST的活性均显著高于空白对照组（P＜0.05）；
与白酒组相比，肝肽酒组小鼠血清中ALT和AST的活性分别显著降低21.82%、23.61%（P＜0.05）。说明大鲵肝肽酒在一定程度上能降低灌胃酒精小鼠血清中ALT和AST活性。
图2 大鲵肝肽酒对小鼠血清谷丙转氨酶（A）和谷草转氨酶（B）活性的影响Fig.2 Effect of Andrias davidianus liver peptide wine on alanine aminotransferase (A) and aspartate aminotransferase (B)activity of mouse serum
本研究以大鲵肝脏和白酒为原料制备大鲵肝肽酒。利用酶解法和膜分离法制备了不同分子质量的肝肽，研究了其体外抗氧化活性及其在不同酒精度白酒中的溶解度，并测定大鲵肝肽酒对小鼠肝脏损伤相关的各项生化指标的影响。结果表明，分子质量＜3 000 Da（10 mg/mL）的大鲵肝肽体外对ADH激活率最高，为83.53%，对DPPH·、·OH和清除率均＞83.50%，且具有较强的还原力（吸光度值0.440）。分子质量越小，在白酒中溶解度越大，其中分子质量＜3 000 Da的肝肽溶解度均达到94%以上。与灌胃白酒组小鼠相比，大鲵肝肽酒组小鼠肝脏ADH、ALDH、SOD活力及GSH含量显著提高（P＜0.05），分别提高66.58%、26.84%、15.84%，36.92%，肝脏MDA、TG含量显著降低（P＜0.05），分别降低17.37%、26.39%，血清ALT和AST活性显著降低（P＜0.05），分别降低21.82%、23.61%。大鲵肝肽酒能增强机体抗氧化能力，减轻肝脏的氧化应激反应；
提高乙醇、乙醛代谢酶的活性，降低乙醇对肝细胞损伤。