李 漓，何雨晴，吴智煌，杨胜辉*，周小江*
湖南中医药大学，湖南 长沙 410208
血吸虫病是一种由裂体属（Schistosoma）寄生虫引起的、广泛流行于热带及亚热带地区的人畜共患病，严重危害人类健康[1-2]。
血吸虫病影响着全球70多个国家或地区，据世界卫生组织统计，全球至少有2.4 亿人感染血吸虫病，超过8 亿人居住在易感染风险地区[1，3]，在我国流行危害较大的是日本血吸虫病[4]。
血吸虫病在我国流行历史悠久，并且流行的范围广泛，截至2020 年底，全国共有450 个血吸虫病流行县（市、区），共有血吸虫病流行乡（镇）3352个、流行村28 376 个，流行村的总人口达7137.04 万人[5-6]。
血吸虫在人等终宿主体内存在虫卵、尾蚴、童虫和成虫4 个阶段[7]。
血吸虫病是一种免疫性疾病，在其感染过程中，尾蚴、童虫、成虫和虫卵均可对人体造成损害，损害的主要原因是不同虫期所释放的抗原均能诱发一系列免疫病理变化，并出现一些并发症[7]。
其中最大的损害是由沉积在肝脏中的虫卵导致肉芽肿及继发性纤维化[8-9]。
由于中药具有多成分、多途径和多靶点协同调控作用特点，因此，在治疗血吸虫病，尤其是血吸虫病肝纤维化时，具有潜在的优势，能够有效控制肝纤维化的发展[10]。巴豆叶收载于《中华本草》，又名双眼龙叶、大叶双眼龙叶，为大戟科植物巴豆Croton tiglium L.的叶，具有祛风活血、杀虫解毒的功效。同时，巴豆叶是傣族、哈尼族、毛南族和德昂族的习用药[11-13]。
巴豆在我国的西南和南部地区均有分布，尤其是云南、四川、广西等地，其资源很丰富[12-13]。
巴豆叶中主要含二萜类、降倍半萜类、生物碱、苯丙素类、挥发油等成分[14-18]，其提取物具有抗氧化、抗肿瘤、杀皮肤寄生虫等作用[19]，其所含二萜类成分具有抗肿瘤、抗结核、抗炎等活性[14-16,20]。
本团队前期从巴豆叶乙酸乙酯提取物（ethyl acetate extract from the leaves of Croton tiglium, EAELCT）中分离鉴定了20 个二萜类化合物，其中12 个为新二萜（含1 个新骨架）[14-16]。
本文在前期的研究基础上，对EAELCT 抗血吸虫病的作用进行研究，以期找到“标本同治”的抗血吸虫药物及为开发利用巴豆叶这一可再生资源打下基础。
1.1 动物
SPF 级昆明小鼠，雌雄各半，体质量18～22 g，购于长沙市天勤生物技术有限公司，许可证号：SCXK（湘）2019-0014，质量合格证：4307262211100423576。小鼠自由摄食及饮水，饲养温度20～25 ℃，室内通风良好。
实验经湖南中医药大学第一附属医院动物实验伦理委员会批准（ZYFY20191115）。
血吸虫感染的阳性钉螺由湖南省血吸虫病防治研究所提供。
在室温和光照条件下将钉螺于去氯水中静置2 h 逸蚴，将水面上的尾蚴收集到15 mL 的塑料离心管中，加入4 ℃预冷的洗涤培养基，离心洗涤2 次，每次5 min，弃去上清液，收集尾蚴，备用。
1.2 药材与试剂
巴豆叶购于成都荷花池药材市场，经湖南中医药大学周小江教授鉴定为大戟科植物巴豆Croton tiglium L.的干燥叶；
吡喹酮片（沈阳红旗制药有限公司，批号：1706071）；
HE 染液、Masson 染液（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：ZLI-9613、G1340）；
IFN-γ、IL-2、IL-5、IL-10、IL-13 ELISA 试剂盒（美国Thermo Fisher 公司，批号：BMS4021、BMS239、BMS603、BMS614、BMS6015）。
其他试剂均为分析纯。
1.3 仪器
高速冷冻离心机（德国eppendorf 公司，型号：5415R）；
细胞培养箱（美国Thermo 公司，型号：HERAcell 240i）；
切片机（德国莱卡公司，型号：RMZ135）；
显微镜（厦门Motic 公司，型号：BA410E）。
1.4 受试药物
取干燥的巴豆叶3 kg，剪碎，加70%的乙醇回流提取2 次，每次1 h，第一次加10 倍量，第二次加8 倍量，滤过，合并提取液，减压回收乙醇，加水超声混悬。
水混悬液采用石油醚萃取脱脂后，分取水层，再加乙酸乙酯进行多次萃取，直至无色，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩后蒸干，得乙酸乙酯提取物136 g，得率为4.53%。
试验时，取EAELCT，加少许DMSO 溶解后，加生长培养基和蒸馏水超声使混悬，分别配制成浓度为34、17、8.5、4.25 μg/mL 的体外试验培养液和浓度为0.015 00、0.007 50 和0.003 75 g/mL 的体内试验供试液。
2.1 体外杀血吸虫童虫试验
血吸虫童虫的培养及分组：取血吸虫尾蚴加5 mL生长培养基（含10%胎牛血清、90% RPMI 1640、200 U/mL 的青霉素、200 μg/mL 的链霉素、2.5 μg/mL的两性霉素B 和10 mmol/L 的4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液），重悬，吸入注射器中，来回反复推压尾蚴20 次左右，使尾蚴脱尾变成童虫，镜检断尾率可达99%以上。离心，去除上清的断尾，收集童虫。分为空白对照组、DMSO 组、吡喹酮组和不同浓度的EAELCT 组。
杀血吸虫童虫：于有童虫的离心管中加入1 mL生长培养基，混匀后，滴加于6 孔板，45 条童虫/每孔。按上述分组，每组加2 mL 不同浓度（34、17、8.5、4.25 μg/mL）含药的生长培养基，空白对照组加入生长培养基。将6 孔板置于37 ℃、CO2培养箱中孵育，分别于24、48、72 h 用显微镜观察虫体变化及生存状况，计算童虫死亡率。
2.2 体内抗血吸虫试验
2.2.1 体内抗血吸虫童虫试验 按照随机数字表，随机选择10 只小鼠作为空白对照组，再参照文献建立血吸虫童虫感染模型[21]，采用腹部贴片法感染小鼠，40 条尾蚴/小鼠，建模成功后随机分为模型组、吡喹酮对照组（0.2 g/kg）、EAELCT 高剂量组（0.3 g/kg）、中剂量组（0.15 g/kg）和低剂量组（0.075 g/kg）。每组10 只。感染后于第1、2、3、4、5、6、7 天连续灌胃不同浓度的EAELCT，吡喹酮对照组于感染后第1、第2天连续灌胃2 d，模型组以等量的生理盐水灌胃。感染后第29 天处死小鼠，收集肝门静脉、肠系膜静脉内血吸虫虫体，计数小鼠体内虫体总数，计算杀虫率，比较各组杀虫率的差异。
2.2.2 体内抗血吸虫成虫试验 按照随机数字表，随机选择10 只小鼠作为空白对照组，再参照文献建立血吸虫成虫感染模型[21]，采用腹部贴片法感染小鼠，20 条尾蚴/小鼠，感染后小鼠随机分组，分组情况同“2.2.1”，每组10 只小鼠。
感染29 d 后用EAELCT连续灌胃7 d，吡喹酮对照组于感染29 d 后连续灌胃2 d，模型组以等量的生理盐水灌胃。感染后第42天处死小鼠，收集肝门静脉及肠系膜静脉内血吸虫成虫，计数虫体总数，计算杀虫率，比较各组杀虫率的差异。
2.2.3 调节小鼠Th1/Th2 型细胞因子的免疫应答 分组及给药同“2.2.1”和“2.2.2”，其中，杀童虫试验：于感染前、感染后第14 天、第29 天分别采集血液；
杀成虫试验：于感染前、感染后第29 天、第42 天分别采集血液。
采用ELISA 试剂盒检测血清中IL-2、IL-5、IL-13、IFN-γ 等细胞因子的含量，比较EAELCT对小鼠在发病过程中相关Th1/Th2 型细胞因子表达的影响。
2.2.4 对血吸虫病小鼠肝纤维化影响 分组及给药同“2.2.2”，于42 d 处死小鼠，分取肝脏。
观察小鼠肝脏的外观变化，取肝左叶0.5 g 置于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋切片进行HE 染色，显微镜下观察肝纤维化的程度，并通过Imagine ProPlus 6.0 图像软件测定小鼠肝组织中虫卵肉芽肿面积，每组测量20 个虫卵肉芽肿，计算各组的平均肉芽肿面积。
3.1 体外杀血吸虫童虫试验结果
与空白对照组对比，各给药组48 h 及72 h 后对血吸虫童虫均有明显杀灭效果，各浓度EAELCT组中血吸虫童虫的死亡率均显著高于空白对照组（P＜0.05）， 其中34 μg/mL EAELCT 组杀童虫效果最好，虫体死亡率显著高于17.00 μg/mL、8.50 μg/mL 和4.25 μg/mL EAELCT 组（P＜0.05），72 h 后童虫死亡率达到100%，EAELCT 体外杀童虫呈明显的剂量和时间依赖性。
详见表1。
表1 EAELCT 体外杀血吸虫童虫的效果(±s)
表1 EAELCT 体外杀血吸虫童虫的效果(±s)
注：与空白对照组比较，#P＜0.05；
与吡喹酮组比较，＆P＜0.05；
与EAELCT（34.00 μg/mL）组比较，*P＜0.05。
组别 血吸虫童虫死亡率/%24 h 48 h 72 h浓度/(μg/mL)每孔童虫数/条空白对照组吡喹酮组DMSO 组EAELCT 组—30.00—34.00 17.00 8.50 4.25 45 45 45 45 45 45 45 10.94 17.39 9.17 21.98#15.69 11.39 5.04＆*18.81 47.30#19.75 71.93#＆41.33#*36.21#*31.93#＆*31.63 56.36#36.67＆100.00#＆88.14#＆*78.33#＆*50.00#*
3.2 体内杀血吸虫试验结果
在体内抗血吸虫童虫试验中，与模型组相比，EAELCT 高、中、低剂量组的每鼠虫荷数均显著减少，显示较好的杀虫率（P＜0.05）。
与吡喹酮组相比，EAELCT 各浓度组的每鼠虫荷数更低（P＜0.05），每鼠杀虫率更高（P＜0.05）。
详见表2。
表2 EAELCT 对血吸虫童虫杀虫效果(±s)
表2 EAELCT 对血吸虫童虫杀虫效果(±s)
注：与模型组比较，*P＜0.05；
与吡喹酮组比较，#P＜0.05。
组别模型组吡喹酮组EAELCT 组每鼠杀虫率/%—21.06±1.83 31.05±3.74#39.05±4.61#43.75±4.89#剂量/（g/kg）—0.200 0.075 0.150 0.300小鼠数/只10 9 9 7 7每鼠虫荷数/条28.73±5.08 22.68±4.79*19.81±7.14*#17.51±7.09*#16.16±3.27*#
在体内抗血吸虫成虫试验中，与模型组相比，EAELCT 高、中、低剂量组中每鼠虫荷数均显著降低（P＜0.05），提示EAELCT 对血吸虫成虫有较好的杀虫效果。与吡喹酮组比较，EAELCT 高、中、低剂量组中每鼠虫荷数更高（P＜0.05），每鼠杀虫率更低（P＜0.05）。
详见表3。
表3 EAELCT 体内对血吸虫成虫杀虫效果(±s)
表3 EAELCT 体内对血吸虫成虫杀虫效果(±s)
注：与模型组比较，*P＜0.05；
与吡喹酮组比较，#P＜0.05。
组别模型组吡喹酮组EAELCT 组剂量/（g/kg）—0.200 0.075 0.150 0.300小鼠数/只10 8 7 9 7每鼠虫荷数/条14.93±3.21 4.02±1.19*9.07±2.58*#7.84±4.41*#6.85±1.81*#每鼠杀虫率/%—73.07±7.59 39.25±3.65#47.49±4.86#54.12±5.98#
3.3 调节血吸虫病小鼠Th1/Th2 型细胞因子的免疫应答结果
体内抗血吸虫童虫试验中，Th1/Th2 型细胞因子的免疫应答结果见图1。
感染后期EAELCT 高、中、低剂量组的Th1 型细胞因子IFN-γ、IL-2 表达水平较模型组明显增加（P＜0.05）；
而EAELCT 高、中、低剂量组的Th2 型细胞因子IL-5、IL-13 表达水平较模型组明显下降（P＜0.05）。
图1 EAELCT 对血吸虫童虫小鼠血清中IFN-γ（A）、IL-2（B）、IL-5（C）、IL-13（D）的影响
体内抗血吸虫成虫试验中，Th1/Th2 型细胞因子的免疫应答结果见图2。
结果表明，感染后期EAELCT 高、中、低剂量组的Th1 型细胞因子IFN-γ和IL-2 表达水平较模型组明显增加（P＜0.05）；
Th2型细胞因子IL-5、IL-13 表达水平较模型组均明显下降（P＜0.05）。
图2 EAELCT 对血吸虫成虫小鼠血清中IFN-γ（A）、IL-2（B）、IL-5（C）、IL-13（D）的影响
3.4 EAELCT 抗血吸虫病小鼠肝纤维化结果
肉眼观察显示，模型组小鼠肝脏颜色发暗，分布有大量的虫卵结节；
EAELCT 不同浓度组的小鼠肝脏颜色较红润，肝脏表面的虫卵结节数目相对较少。HE染色显示，模型组有大量的虫卵肉芽肿，炎症细胞浸润明显，而EAELCT 高、中、低剂量组较模型组的虫卵肉芽肿面积明显减小（P＜0.05）。
详见图3、表4。
表4 虫卵肉芽肿面积对比(±s)
表4 虫卵肉芽肿面积对比(±s)
注：与模型组比较，*P＜0.05；
与吡喹酮组比较，#P＜0.05。
组别剂量/（g/kg）模型组吡喹酮组EAELCT 组—0.200 0.075 0.150 0.300测量的虫卵肉芽肿数/个20 20 20 20 20测量的虫卵肉芽肿面积/μm2 51 047.85±3 641.25 26 347.49±1 926.54*41 567.27±2 986.76*#40 648.73±2 647.12*#34 964.75±2 346.45*#
图3 各组小鼠肝脏HE 染色比较（×100）
血吸虫病严重威胁人类健康，晚期可导致肝硬化、腹水和上消化道大出血等多种并发症。
血吸虫感染机体后即使体内的血吸虫虫体被杀灭，但沉积在肝脏中的虫卵仍然可能会导致肉芽肿和肝纤维化。因此，血吸虫病肝纤维化是当前的治疗难题。目前，血吸虫病的首选治疗药物为吡喹酮，但它不能改变肝纤维化进程或逆转肝纤维化，且有产生耐药性的情况[22-23]。
因此，本文特选择具有杀虫解毒功效的多民族用药巴豆叶进行研究。
巴豆叶作为傣族、哈尼族、毛南族和德昂族的习用药，在我国分布面广，资源丰富。
本研究发现，EAELCT 不仅有较好的杀血吸虫作用，而且能调节Th1/Th2 型细胞因子的免疫应答和改善肝纤维化，显示了中药多成分、多途径和多靶点协同调控作用的特点。
本研究结果表明，EAELCT 在体外对血吸虫童虫显示出较好的杀虫活性，各浓度EAELCT 组中血吸虫童虫的死亡率均显著高于空白对照组和吡喹酮组；
体内抗血吸虫试验进一步证实EAELCT 对血吸虫童虫具有较好的杀虫效果，但对血吸虫成虫的杀虫效果不及吡喹酮。
多位学者的研究[24-25]证实，某些中药的提取物中含有杀血吸虫的活性物质。
刘晨晨等[24]发现白头翁提取物中的单体BTW5 对体外培养日本血吸虫成虫及童虫具有较好的杀灭作用。
陈岩勤等[25]学者证实，白头翁总皂苷（PRS）对体外培养的日本血吸虫童虫和成虫具有显著的杀虫活性，30 μg/mL PRS 作用4 h 后，日本血吸虫童虫及成虫全部死亡，杀虫率达到100%。
这些研究提示，从传统中草药中探寻具有预防和治疗血吸虫感染的活性成分，有助于为临床开发新型血吸虫病治疗药物提供参考和借鉴。然而，中药抗血吸虫的具体机制目前尚不完全清楚。
为进一步探讨EAELCT 抗血吸虫病肝纤维化的机制，本课题组进一步研究了EAELCT 对血吸虫感染小鼠血清中Th1/Th2 型细胞因子分泌的调节作用。血吸虫病肝纤维化过程中，Th2 型细胞及其分泌的细胞因子IL-4、IL-5、IL-10 和IL-13 等发挥了重要作用[26]。在血吸虫感染早期即感染后6 周内，主要由Th1 型细胞因子如IL-2、IFN-γ 等发挥免疫功能，同时抑制Th2 型细胞应答，实现早期抗寄生虫感染作用；
同时，Th2 型细胞因子表达逐渐升高，8～12 周达到最高水平，随后慢慢减少[26-27]。
该过程引起以IL-4 和IL-13 介导的Th2 占主导的免疫反应，趋化嗜酸性粒细胞、肝星状细胞和淋巴细胞等细胞在虫卵周围浸润，形成以虫卵为中心的肉芽肿，最终促进肝纤维化形成[26-27]。
本实验结果表明，体内杀血吸虫童虫过程中，EAELCT 高、中、低剂量组的Th1 型细胞因子IFN-γ、IL-2 表达水平较模型组明显增加；
而EAELCT 高、中、低剂量组的Th2 型细胞因子IL-5、IL-13 表达水平较模型组明显下降。EAELCT 刺激Th1 型细胞因子IFN-γ、IL-2 的表达，抑制Th2 型细胞应答，下调Th2 型细胞因子IL-5、IL-13 的表达，在一定程度上抑制和逆转肝纤维化形成。
本研究通过EAELCT 体内外抗血吸虫的活性研究及对血吸虫感染小鼠血清Th1/Th2 型细胞因子分泌的调节作用研究，显示EAELCT 体内外具有一定的抗血吸虫活性，同时具有一定的改善血吸虫病肝纤维化的作用，但其具体机制尚未进行深入研究，有待于进一步探索。
本文的研究结果，为EAELCT的进一步研究和开发利用提供了实验依据。
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