血清miRNA-21、AFP、AFP-L3联合检测在肝细胞癌诊断和预后评估中的价值

解学芳，焦玲，田斌，常晓雨

肝细胞癌(HCC)是原发性肝癌的主要类型，占89%～90%，其死亡率约占相关癌症死亡原因的第三位[1-2]。我国是肝癌的高发国家，肝癌死亡率仅次于肺癌，排第二位，给我国人民健康带来严重威胁[3]。HCC早期无特异性临床表现症状，一旦出现乏力、黄疸、疼痛相关症状来医院就诊时大多处于中晚期，从而丧失了早期最佳手术、介入等治疗机会，患者预后极差。超声、CT是肝癌常规影像学检查方法，但对于小肝癌容易造成误诊和漏诊[4]。血清肿瘤相关标志物检查在恶性肿瘤的早期诊断及预后随访中越来越受到临床关注。甲胎蛋白(AFP)一直作为诊断HCC最为经典、应用最为广泛的标志物，但仍有20%～30%HCC患者血清呈阴性；
甲胎蛋白异质体L3(AFP-L3)为肝癌细胞所特有，诊断HCC特异性高，但仍有15%～30%的HCC患者表达阴性[5]。miRNAs是一类非编码单链小RNA分子，在机体生理、病理等生命活动中发挥着重要生物学作用，其表达异常严重影响细胞信号转导途径，致使细胞增殖和分化异常从而失去控制，最终导致肿瘤的发生和发展[6]。微小RNA-21(miRNA-21)是发现和研究较早的miRNA之一，研究表明[7]miRNA-21异常表达与HCC发生发展密切相关，可作为新型标志物用于HCC诊断。本研究拟选择血清miRNA-21、AFP、AFP-L3三项标志物联合检测，评价其在HCC诊断与预后评估中的价值。

1.1 临 床 材 料 收 集2016 年1 月 至2018 年12 月101例来日照市人民医院就诊的HCC患者为研究对象列为HCC组，均经病理组织学确诊。男58例，女43例；
年龄39～82岁，平均年龄(58.97±15.46)岁。另选取50例肝脏良性病变患者作为对照组，包括乙肝、丙肝、肝硬化等，男33例，女17例；
年龄36～85岁，平均年龄(59.26±14.37)岁，均经影像学、血清学、病理组织学排除癌变。两组人群性别、年龄等基线资料比较差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 选取标准 纳入标准：符合《原发性肝癌诊疗规范(2019年版)》诊断标准[8]；
均为首次确诊者；
研究所需资料齐全；
患者知情同意，全程配合该项研究。排除标准：排除非原发性肝癌患者；
排除伴有其他系统恶性肿瘤患者；
排除研究所需资料不全者。

1.3 方法 早06：00—09：00时空腹抽取两组患者肘静脉血8 mL，自凝后离心分离血清待检。miRNA-21采用实时定量荧光聚合酶链反应法检测，抽提总RNA试剂盒(Molecular Research Centre公司，美国)，合成第一链cDNA试剂盒(Fermentas公司，以色列)，qRT-PCR引物(miR-21和miR-16)(上海英骏生物公司)，PCR仪购于美国Bio-Rad公司，以miRNA-16作为内参，采用2-ΔΔCt的方法计算血清miRNA-21 相对表达量；
AFP 采用德国罗氏公司ELecsys-2010 及配套试剂电化学发光法检测；
AFP-L3采用亲和吸附离心管法检测，试剂盒由北京热景生物技术有限公司提供，以2005年美国FDA设定AFP-L3/AFP≥10%作为阳性判断标准。

1.4 结果判定 血清miRNA-21、AFP、AFP-L3单项检测超过临界值即判定为诊断HCC阳性，等于或低于临界值即判定为诊断HCC阴性；
血清miRNA-21、AFP、AFP-L3联合检测有一项或一项以上指标超过临界值即判定为诊断HCC阳性，均等于或低于临界值即判定为诊断HCC阴性。

1.5 预后随访 患者出院后对其定期追踪回访，随访时间3～36个月。嘱患者自初次治疗结束后定期来医院复查，复查频率为每3个月一次，复查内容包括血清学及影像学检查。随访过程中发现有复发灶、新的转移灶或死亡均被定义为“事件”，随时停止随访；
至随访终点未发现新的复发灶、无发现新的转移灶或无死亡均被定义为“无事件”。记录每次患者复查资料。

1.6 统计学方法 研究所得数据应用SPSS 23.0统计学软件进行统计处理，以均数±标准差(±s)表示计量资料，行t检验；
以率[n(%)]表示计数资料，行χ2检验；
生存分析利用Kaplan-Meier 法及Log-rank检验；
以病理诊断结果为金标准，用四格表法统计计算血清miRNA-21、AFP、AFP-L3 单项、两两组合及三项联合检测诊断HCC价值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 HCC组与对照组血清miRNA-21、AFP、AFP-L3水 平 比 较 HCC 组 患 者 血 清miRNA-21、AFP、AFP-L3水平明显高于良性对照组(P＜0.01)，见表1。

表1 HCC组与对照组血清miRNA-21、AFP、AFP-L3水平比较(±s)

表1 HCC组与对照组血清miRNA-21、AFP、AFP-L3水平比较(±s)

注：miRNA-21=微小RNA-21，AFP=甲胎蛋白，AFP-L3=甲胎蛋白异质体L3，下同；
与对照组比较，aP＜0.01。

组别 例数 miRNA-21 AFP/(ng·mL-1) AFP-L3/(%)HCC组 101 13.06±4.23a 298.26±96.87a 16.44±5.23a对照组 50 1.26±0.47 17.39±3.12 7.69±2.98 t值 19.631 20.452 10.972 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 HCC 不同临床病理因素患者血清miRNA-21、AFP、AFP-L3 表达水平比较 HCC组患者血清miRNA-21、AFP、AFP-L3表达水平与性别、年龄、肿瘤部位无明显相关性(均P＞0.05)；
与肿瘤直径、临床分期、肝功能分级、转移、复发、治疗明显相关，肿瘤直径＞5 cm、临床高分期、肝功能C级、转移、复发及治疗前血清miRNA-21、AFP、AFP-L3表达水平明显高于肿瘤直径≤5 cm、临床低分期、肝功能A/B级、无转移、无复发及治疗后血清水平(均P＜0.01)，见表2。

表2 HCC不同临床病理因素患者血清miRNA-21、AFP、AFP-L3表达水平比较(±s)

表2 HCC不同临床病理因素患者血清miRNA-21、AFP、AFP-L3表达水平比较(±s)

注：组内分别比较，bP＞0.05，cP＜0.01。

临床病理因素 例数 miRNA-21 t值 P值 AFP/(ng·mL-1) t值 P值 AFP-L3/% t值 P值性别 0.708 ＞0.05 1.522 ＞0.05 1.968 ＞0.05男58 13.34±4.15b 312.54±101.36b 17.32±5.73b女43 12.68±5.21 281.33±95.47 15.27±4.31年龄/岁 0.544 ＞0.05 1.277 ＞0.05 1.723 ＞0.05≤60 45 12.77±3.79b 284.59±102.33b 15.34±5.06b＞60 56 13.29±5.44 309.25±98.76 17.32±6.23肿瘤发生部位 1.901 ＞0.05 0.633 ＞0.05 0.702 ＞0.05左肝 53 12.20±5.47b 304 48 14.01±3.87 291 5.467 ＜0.01 40 10.06±2.32 210 61 15.23±5.67c 356 11.172 ＜0.01 60 8.35±3.12 211 41 20.13±7.26c 413.52±110.35b 16.03±6.57b右肝 .35±97.62 16.89±5.64肿瘤直径/cm 6.942 ＜0.01 4.481 ＜0.01≤5 .34±79.35 13.01±4.37＞5 .28±116.32c 18.69±7.21c临床分期 9.168 ＜0.01 10.123 ＜0.01Ⅰ+Ⅱ .16±65.19 10.82±4.21Ⅲ+Ⅳ .62±152.13c 24.67±9.32c肝功能分级 9.506 ＜0.01 10.213 ＜0.01 9.061 ＜0.01 A级+B级 79 10.53±3.97 221.16±75.23 12.11±4.69 C级 22 22.13±7.89c 465.27±159.34c 25.79±10.16c淋巴结转移 8.673 ＜0.01 3.431 ＜0.01 4.687 ＜0.01无36 7.36±2.88 248.22±73.61 12.13±4.66有65 16.23±5.74c 326.29±125.63c 18.67±7.21c远处转移 9.441 ＜0.01 10.523 ＜0.01 8.565 ＜0.01无82 10.71±4.03 254.16±77.65 13.62±5.17有19 23.19±8.67c 532.69±179.82c 28.37±11.46c复发 14.470 ＜0.01 13.452 ＜0.01 8.290 ＜0.01无80 10.53±4.12 222.14±82.43 13.49±4.89有21 22.69±6.64c 596.33±192.14c 27.69±12.13c治疗 22.231 ＜0.01 27.106 ＜0.01 14.335 ＜0.01前101 13.06±4.23c 298.26±96.87c 16.44±5.23c后101 3.27±1.32 35.27±5.69 7.23±3.79

2.3 血清miRNA-21、AFP、AFP-L3水平对HCC患者预后的影响 随访3年，HCC患者血清肿瘤标志物高水平表达组(miRNA-21＞18.13、AFP＞432.15 ng/mL、AFP-L3＞23.86%) 无事件发生率明显低于低水平表 达 组(miRNA-21 ≤18.13、AFP ≤432.15 ng/mL、AFP-L3≤23.86%)，差异有统计学意义(χ2＝11.867、18.929、9.666，P＝0.001、＜0.001、0.002)，P＜0.01，见图1～3。

图1 血清miRNA-21水平与HCC治疗后3年生存状况关系

图2 血清AFP 水平与HCC治疗后3年生存状况关系

图3 血清AFP-L3水平与HCC治疗后3年生存状况关系

2.4 血清miRNA-21、AFP、AFP-L3三项联合检测

诊断HCC的价值比较 绘制ROC曲线求取血清miRNA-21、AFP、AFP-L3 诊断HCC临界值。血清miRNA-21、AFP、AFP-L3 诊断HCC的曲线下面积(AUC)分别为0.869(95%CI：0.761，0.892)、0.789(95%CI：0.717，0.860)、0.763(95%CI：0.695，0.843)；
约登指数分别为0.776、0.654、0.603；
诊断HCC临界 值 分 别 为miRNA-21：2.78，AFP：22.69 ng/mL，AFP-L3：10.98%。

血 清miRNA-21、AFP、AFP-L3 诊 断HCC实 验室结果与病理诊断结果对照，见表3；
以病理诊断为金标准，血清miRNA-21、AFP、AFP-L3单项及联合检测诊断HCC价值，见表4。血清miRNA-21、AFP、AFP-L3三项联合检测诊断HCC的敏感性、准确性、阴性预测值与各单项及两两组合比较明显提高(P＜0.01)。

表3 血清miRNA-21、AFP、AFP-L3诊断HCC实验室结果与病理诊断结果对照(n)

表4 血清miRNA-21、AFP、AFP-L3单项及联合检测诊断HCC的价值比较 单位：%

血清肿瘤标志物检测是具有标本采集方便、可定量及动态测定等特点的一项无创性筛查恶性肿瘤的体外诊断实验[9]。相关研究报道[10]，血清肿瘤标志物在恶性肿瘤早期就有升高现象，往往比影像学改变及患者出现临床症状提前4～6个月，其检测适合恶性肿瘤高危人群筛查、早期诊断及预后随访[11]。由于恶性肿瘤基因及发病机制的复杂性，一种恶性肿瘤可以产生多种与之相关的标志物，或一种标志物可以在多种恶性肿瘤表达，它们的敏感性、特异性不尽相同，有选择的数种标志物联合检测，可有效提高诊断恶性肿瘤的准确性[12]。miRNA-21、AFP、AFP-L3等与HCC发生、发展密切相关，它们都可作为HCC诊断的生物学指标。

多种恶性肿瘤如肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌等发生发展与miRNAs密切相关，miRNA在其过程中通过对蛋白编码基因的调控发挥类似抑癌基因或癌基因的作用[6]。miRNA-21 作为miRNAs 一员，其在HCC的发生发展、侵袭转移、免疫调控等多方面发挥着重要生物学作用[13]。miRNA-21作为癌基因促进肝癌细胞的增殖和转移，在HCC早期血清miRNA-21升高现象比AFP明显，可以作为诊断HCC 早期诊断的预警标志物[14]。外周血miRNA-21水平与HCC的生物学行为如肿瘤大小、肝功能分级、临床分期、复发转移等高度相关，有效治疗后随着瘤体负荷减少或瘤体消失，血清miRNA-21水平与治疗前比较明显下调，可以作为监控预后的指标[7]。AFP是一种糖蛋白，由妊娠期胎儿肝脏和卵黄囊产生的，出生后外周血含量一般小于20 ng/mL[15]。当肝组织细胞发生癌变时，肝癌细胞内AFP合成基因被激活而大量产生和分泌AFP，释放到外周血液中，外周血液含量增高，甚至超过1 000 ng/mL[16]。我国《原发性肝癌诊疗规范》 要求AFP作为原发性肝癌筛查、诊疗中必查的血清学指标[8]。高浓度AFP抑制机体正常免疫应答，从而促进肝癌细胞增殖、转移及侵袭[17]。AFP-L3称为AFP异质体，为肝癌细胞特有产生，一般以AFP-L3%代表血清表达量，AFP-L3%是指AFP-L3 占AFP 总量的百分比，AFP-L3%是HCC生物学恶性程度的一个标志[18]。2005年美国FDA把AFP-L3%≥10%作为肝癌的预警临界值，如果患者血清AFP-L3%≥10%提示罹 患HCC 的 可 能 性 很 大[19]。

早 期HCC 血 清AFP-L3%出现升高现象要早于影像学改变，因此AFP-L3%的测定对HCC的早期诊断具有重要意义，如果术后AFP-L3%水平变化不明显，提示癌组织有残留[20]。

本研究结果显示，HCC组患者血清miRNA-21、AFP、AFP-L3水平明显高于对照组(P＜0.01)；
肿瘤直径≥5 cm、临床高分期、肝功能C级、转移、复发、治疗前血清miRNA-21、AFP、AFP-L3水平明显高于肿瘤直径≤5 cm、临床低分期、肝功能A/B级、无转移、无复发、治疗后血清水平(均P＜0.01)。虽然miRNA-21、AFP、AFP-L3都可以作为诊断HCC血清学指标，但单独性检测价值有限，血清miRNA-21、AFP、AFP-L3联合检测做到相互印证、相互补充，诊断HCC敏感性、准确性明显提高，从而减少误诊、漏诊；
依据生存曲线评估预后。

综上所述，血清miRNA-21、AFP、AFP-L3三项联合检测有利于HCC早期诊断、监控病情及预后评估。

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