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两个侧耳科真菌的形态学及ITS鉴定

时间:2023-06-14 18:05:03 来源:网友投稿

田慧敏 王秀艳 吕国帅 曹 蝶 刘 爽

(赤峰学院生命科学学院,内蒙古赤峰 024000)

侧耳属Pleurotus(Fr.)P.Kumm.建属于1871 年,最初隶属于担子菌门(Basidiomycotina)、伞菌目(Agaricales)、口 蘑 科Tricholomataceae[1]。1951 年Singer 在研究多孔菌相关属的子实层髓时指出香菇属Lentinus、革耳属Panus、侧耳属Pleurotus应归为多孔菌科[2]。1980年Kühner将该属从多孔菌科分离出来独立成侧耳科Pleurotaceae Kühner[3]。《菌物字典》第10版的分类系统,侧耳属隶属于侧耳科(Pleurotaceae),该科包括侧耳属Pleurotus、亚侧耳属Hohenbuehelia等[4]。该科真菌一般木生,多为掌状或扇状的担子果,菌褶延生,色浅,常白色;
菌柄侧生、偏生、中生或无柄,孢子印白色,担孢子无色,长椭圆形或腊肠形。据统计,我国现有侧耳科真菌52种,其中侧耳属36 个种、5 个变种,亚侧耳属11 个种[5-6]。该科真菌多数种类具有重要的经济价值或药用价值,在我国的栽培面积较广。据统计,2019年我国侧耳类食用菌的产量达600 万t[7],并逐年上升,主要栽培种有糙皮侧耳Pleurotus ostreatus(Jacq.)P.Kumm.、肺形侧耳(凤尾菇)P.pulmonarius(Fr.)Quél.、金顶侧耳P.CitrinopileatusSinger、囊状侧耳P.cystidiosusO.K.Mill.,扇形侧耳P.flabellatusSacc.、美味侧耳P.SapidusQuél.和阿魏侧耳P.eryngiivar.Ferulae(Lanzi)Sacc.等。部分侧耳属真菌可以专性产毒,在防治线虫中具有重要应用价值[8-11]。同时侧耳科真菌多数为木腐菌,有利于维持生态平衡,促进环境修复[12-13]。根据真菌索引统计,侧耳科真菌有900 多种(包括变种、亚种等),其中侧耳属758 种,亚侧耳属192 种[14],而我国仅有50 余种。笔者对采自内蒙古自治区赛罕乌拉自然保护区桦树上的2 个野生侧耳菌株采用形态学与ITS 测序相结合的方法进行分类鉴定,为食用菌品种的鉴别、菌种的纯化提供理论依据。

1.1 供试标本来源

供试标本CFSZ 10112和CFSZ 10286由刘铁志、田慧敏、赵艳龙、万威、吴晶等于2013年8月15日采自内蒙古赤峰市巴林右旗赛罕乌拉国家级自然保护区(东经118°18"~118°55",北纬43°59"~44°27"),同时拍摄彩色生境照片,晾干后制成干标本存放于赤峰学院菌物标本室(CFSZ)。

1.2 形态鉴定

观察新鲜子实体形状、颜色、附属物、菌褶着生方式、菌柄等并测量其大小,颜色主要依据采集时拍摄的彩色照片判断;
宏观特征以观察2 个以上子实体为依据,显微结构观察担孢子、担子、囊状体、子实层菌丝,菌盖表皮菌丝等结构。孢子大小以不同孢子的长宽范围为依据,将标本的菌褶、菌盖表皮等组织做成徒手切片(通常以4%~5%KOH 溶液作为浮载剂)。孢子测量25~30 个,其他结构测量10~20 个,然后进行形态学分类鉴定,用显微照相系统(Olympus BX53)拍摄显微结构。

1.3 ITS测序鉴定

1.3.1 基因组DNA的提取、PCR扩增及测序

干品子实体菌盖部分经研磨称量30 mg 后,按照参考文献[15]完成PCR 扩增反应,正向引物和反向引物为ITS1/ITS4 引物[16]。PCR 扩增产物经Takara胶纯化试剂盒(大连宝生物工程有限公司)纯化回收后委托上海生工生物科技有限公司完成测序。

1.3.2 ITS序列比较和系统发育分析

将已测序列在GenBank 和UNITE 数据库中进行Blast 比对,从结果中挑选出同源性较高的ITS 序列,采用软件MEGA5.1构建发育树,比较亲缘关系,构建系统发育树。

2.1 形态学鉴定结果

经形态学鉴定,CFSZ10112 为肺形侧耳Pleurotus pulmonarius(Fr.)Quél.,CFSZ10286 为暗蓝亚侧耳Hohenbuehelia atrocoerulea(Fr.)Singer。

2.1.1 CFSZ10112标本特征

担子果丛生,菌盖直径为1.8~7.0 cm,扇形(肾形、倒卵形),不黏,灰白色、白色或米白色;
边缘色浅,表面光滑,边缘有时稍内卷,成熟后呈波浪状。菌褶白色,延生,不等长,干后米白色。菌柄短或无,(0.6~2.0)cm ×(1.0~1.5)cm,侧生,白色;
基部有白色短绒毛(图1a)。

孢 子(7.5~10.0)µm×(3.0~5.0)µm,(Q=1.95~2.77,Q=2.53±0.39),长椭圆形或圆柱形,常有小尖,光滑,无色,非淀粉质(图1b、d)。担子(19.2~29)µm×(5.0~7.2µm),棒状,4 个小梗,较细,长2.5~4.0µm,梗径小于0.5µm,无色(图1c),担子基部具锁状联合。菌丝直径5.0~8.4µm,无色透明,薄壁,具隔膜,锁状联合多(图1d),菌髓菌丝不规则排列。菌盖表皮由无色菌丝组成,薄壁,分枝多,具较多锁状联合,似菌褶菌丝,菌丝直径4.8~7.2µm(图1e),菌盖菌丝无色。菌柄表皮有排列整齐的无色菌丝组成。

图1 CFSZ10112标本子实体形态及微观结构

2.1.2 CFSZ10286标本特征

担子果叠生,菌盖直径为1.7~2.6 cm,扇形(半圆形、肾形),表面黄褐色、深棕色至灰棕色,边缘色浅(黄棕色),表面密被灰褐色、暗棕绿色短绒毛,盖缘处绒毛少,边缘内卷或波浪状(图2a),菌褶白色,干后米白色,稀,每毫米2~3 片,延生,不等长;
菌柄无,菌褶延伸至假菌柄,长度0.5~1.0 cm(图2b)。菌肉白,两层,上层为灰色,下层为白色菌肉,孢子印白色。

担孢子(5.7~8.2)µm×(3.1~4.6)µm,(Q=1.95~2.77,Q=2.53±0.39),长椭圆形,腊肠形,有小尖,光滑,无色,非淀粉质(图2c);
担子(14.6~45.6)µm×(4~5.3)µm,棒状,四个小梗,担子基部未见锁状联合,褶侧囊状体多,(31.5~67.2)µm×(10.0~12.5)µm,壁厚,梭形、纺锤形或腹鼓形,有的顶端具有无色透明颗粒状结晶帽状结构(图2d、e)。褶缘囊体棒状,(19~35)µm×(5.5~8.0)µm,子实层菌丝无色透明,壁薄,具隔膜,具锁状联合且多,5.0~8.4µm(图2f),菌髓菌丝凝胶化,无色,具锁状联合。菌盖表皮由顶端浅黄色菌丝组成,密集处呈棕色,菌丝直径为4.8~6.2µm,壁薄,无色,有隔膜,顶端钝圆,渐变窄(图2g);
菌柄表皮有排列整齐的无色菌丝组成。

图2 CFSZ10286标本子实体形态及微观结构

2.2 rDNA-ITS测序鉴定结果

经检测CFSZ10112 长度为676 bp(登录号为KR086878、KR086879);
CFSZ10286 为667 bp(登录号为KR082882)。

2.3 系统发育分析

以Tricholoma matsutake作为外群,对CFSZ 10286、CFSZ 10112 两个标本的ITS 序列及相似序列等21 个ITS 序列构建系统发育树(图3)。结果聚为三类,第一组为侧耳属Pleurotus,第二组为亚侧耳属Hohenbuehelia,第三组为扇菇属Panellus、小香菇属Lentinellus,CFSZ10112与P.pulmonarius(Fr.)Quél.及Lentinus sajor-caju(Fr.)Fr.聚为一类,CFSZ 10286与H.reniformis(G.Mey.)Singer、H.grisea(Peck)Singer、H.atrocoerulea(Fr.)Singer 聚为一类,结合形态特征将CFSZ10112 鉴 定 为肺 形 侧 耳P.pulmonarius(Fr.)Quél.,CFSZ 10286 鉴定为暗蓝亚侧耳H.atrocoerulea(Fr.)Singer。

表1 与供试侧耳2个标本ITS序列相似的序列

图3 供试标本及来自Genbank的最相似物种的ITS序列的NJ系统发育树

CFSZ10112 与 糙 皮 侧 耳P.ostreatus(Jacq.)P.Kumm.、白侧耳P.albellus形态上相似,但糙皮侧耳子实体覆瓦状叠生,浅灰色,褐灰色,而该标本菌盖灰白色或米白色,白侧耳P.albellus具有较大白色或米白色菌盖,最大直径可达11 cm[5,17],但供试标本菌盖颜色浅黄褐色或肉色。分子水平分析结果,肺形侧耳Pleurotus pulmonarius与Lentinus sajor-caju相似度为99%以上,而L.sajor_caju、P.sajor_caju与P.pulmonarius是同物异名[18],是同一种,因此将CFSZ10112鉴定为肺形侧耳Pleurotus pulmonarius(Fr.)Quél.。

分子水平分析表明,标本CFSZ 10286 与H.reniformis(G.Mey.)Singer、H.grisea(Peck)Singer、H.atrocoerulea(Fr.)Singer相似度高(99%),较难区分,而H.grisea有长1.0~1.5 cm 的菌柄,有较多结晶的盖囊体[5,19],CFSZ 10286 无此特征。H.reniformis菌盖被白色或灰白色细绒毛,孢子较大(10~14)µm ×(5~6)µm[5],而CFSZ 10286 菌盖被灰褐色、暗棕绿色短绒毛,孢子(5.7~8.2)µm×(3.1~4.6)µm,综合其他特征将CFSZ 10286 鉴定为暗蓝亚侧耳H.atrocoerulea(Fr.)Singer;
该种可食,同时含有灰侧耳素,具有抗菌作用,对线虫具有防治效果[5,20],具有潜在经济价值,我国仅分布于海南省,为内蒙古新记录种。

研究结果为我国侧耳科真菌的分布及资源现状做了重要补充,对我国菌物资源生物多样性研究和可食用菌开发利用提供依据。

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