武世珍，靖吉强，李 舫，张兴娟
（山东畜牧兽医职业学院 山东 潍坊 261061）
近几年，蛋鸡养殖快速发展，养殖条件不断改善，但在淘汰蛋鸡屠宰检疫过程中，常发现蛋鸡十二指肠及附近组织出现白色肿瘤样病变，造成鸡胴体废弃，有些鸡群胴体废弃率达2 % 以上，给蛋鸡养殖造成严重的危害。笔者对发病鸡群进行了病因调查和防控措施的探讨。
发病鸡群中大部分鸡精神、食欲正常，每天的产蛋量相对稳定，但稳中有降。少部分鸡精神沉郁并逐渐加重，体重渐进性减轻，产蛋减少且蛋壳质量变差，严重时停止产蛋。剖检病鸡，有时见胸肌萎缩，血液稀薄。剪开腹壁，十二指肠、胰腺、腺胃壁、肠系膜、输卵管壁、腹壁均见肿瘤（图1、图2），但肝脏、脾脏大小基本正常。肿瘤有不断向周围组织蔓延的趋势。病鸡气管、食道、心脏、肾脏、卵巢未见异常。鸡群发病率在4 %~10 %，病死率和发病率相当。头孢类抗生素治疗无效果。
图2 病鸡胰腺、腹膜出现肿瘤
2.1 病理学诊断
用锋利手术刀一次性切下十二指肠上的肿瘤组织，修成2mm×2mm×3mm 的小组织块，用10 % 福尔马林固定，脱水透明，浸蜡、包埋，切片、贴片，苏木精-伊红染色，封片，用显微镜观察。
2.2 RT-PCR 检测禽白血病病毒
2.2.1 引物合成参考 DB21⁄T1889—2001《禽白血病诊断技术规程》合成下列引物：F:AAGTAA GGTGGTACGATCTG，R: CTGCTTCATTCAGGT GTTCGCAAT，该特异性引物扩增的目的基因是禽白血病病毒LTR 序列，扩增片段为220 bp。
2.2.2 核酸提取 利用北京索莱宝科技有限公司的总RNA 提取试剂盒提取核酸，主要步骤是：取100 mg 肿瘤组织加1 ml 裂解液，用匀浆器匀浆，室温放置5 min，向匀浆液体中加0.2 ml 氯仿，振荡 0.5 min，25 ℃ 放置 5 min。4 ℃12 000 rpm 离心10 min，把水相转移到新离心管中。收集的液体中加入200 µl 无水乙醇混匀，然后加入经前处理后的吸附柱静置 2 min，4 ℃12 000 rpm 离心2 min，弃废液。向吸附柱中加入600 µl 漂洗液，4 ℃ 12 000 rpm 离心2 min，弃废液。漂洗2 次后，12 000 rpm 离心2 min，弃掉收集管，将吸附柱置于室温放置10 min，然后将吸附柱放入新离心管中，向柱中央滴加100 µl 无 RNA 酶 水， 室 温 放 置 5 min ，12 000 rpm 离心2 min 即得到RNA。
2.2.3 RT-PCR 检测 利用北京索莱宝科技有限公司的通用RT-PCR 试剂盒，在42 ℃ 反应1h，取2 µl 作为模板进行PCR 反应。PCR 反应条件：95 ℃ 1 min；
94 ℃ 0.5 min，55 ℃ 0.5 min；
72 ℃ 0.5 min；
35 个循环，72 ℃ 10 min。
3.1 病理切片观察
淋巴母细胞样瘤细胞形态大小较一致，肿瘤病灶聚集性生长（图3），形成瘤细胞集中区域，挤压周围组织。
图3 淋巴母细胞样瘤细胞聚集性生长（HE 染色1000 倍）
3.2 RT-PCR 检测禽白血病病毒结果
取5 µl PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，取出凝胶板置于凝胶成像仪进行观察。扩增出了220bp 目标片段（图4）。将PCR 产物送上海生工进行测序。将所得序列在NCBI 数据库进行比对，比对结果表明，该序列与禽白血病病毒的核酸同源性在98 %～100 %（图5）。说明该病例存在禽白血病的感染。从系统进化树可看出：本病例中禽白血病病毒与在美国禽白血病病毒分离株核酸同源性最近，与湖北、广东分离到的禽白血病病毒核酸同源性稍远，同2021 年比利时从肉鸡体内分离的禽白血病病毒的核酸同源性最远（图6）。由此可推测，禽白血病病毒在不同地区的传播可能与引进种鸡、鸡产品交易等有关。对疑似病鸡进行及时检测，对于控制该病具有重要意义。
图4 禽白血病病毒目的片段电泳结果
图5 核酸比对结果
图6 系统进化树
3.3 诊断结论
根据这种蛋鸡肿瘤病的流行特点、症状、病变，结合实验室检测，可初步诊断为禽白血病病毒感染。对发病蛋鸡场采取禽白血病净化、消毒等综合措施，病情得到了控制。由于禽白血病病毒不断变异，深入研究蛋鸡近年来十二指肠及其附近组织频繁出现白色肿瘤的深层原因是十分必要的。
4.1 检测、净化蛋种鸡群，生产无禽白血病的蛋鸡苗
禽白血病的流行，给蛋鸡生产造成了严重经济损失[1]。实行全进全出制，阻断垂直传播，是控制该病的重要措施。蛋种鸡场不从禽白血病阳性鸡场引入种鸡、种蛋。引入的种鸡应先隔离饲养，检测白血病抗体，并关注临床表现，坚决淘汰阳性鸡。蛋种鸡开产后，定期检测鸡群血清中A、B 或J 亚群 ALV 抗体水平，一旦异常，及时采取扑灭措施。
4.2 鸡场强化生物安全措施
把好疫苗关，选择正规厂家的疫苗。杜绝使用被外源性 ALV 污染的弱毒疫苗、卵黄液或其他生物制品。注射疫苗时，要及时更换针头。种蛋应及时收集，熏蒸消毒，孵化场，育雏室严格消毒，减少早期感染。鸡场要远离家禽屠宰场、化工厂、交通要道、村庄等。鸡场内布局要合理，办公区、生产区、粪污处理区要分开。生产区内脏道和污道分开，注意防鸟灭鼠。鸡场门口设消毒池，生产人员更衣、换鞋、淋浴后才能进入鸡舍。设立远程观察系统和报警装置，减少人员进鸡舍的次数。禁止无关人员进入鸡舍。
4.3 建立优良公鸡精液站
ALV 感染鸡可导致肿瘤发生和免疫抑制[2]，因此定期对公鸡进行禽白血病健康检查，确保公鸡精液不携带外源性 ALV 具有重要经济意义。建立优良公鸡精液站，推广人工授精，减少因精液污染外源性 ALV 而造成的疫情扩散。人工授精时注意输精器械的消毒，减少人为传播。
4.4 建立纯种鸡保护制度
增加纯种鸡保护经费的投入，优化各种生物安全措施，定期检测禽白血病。加强禽白血病的实验室快速监测方法的研究，特别是分子生物学诊断[3]和抗体检测方面，进一步降低禽白血病检测成本和提高准确率。加强育种工作，利用基因编辑技术培育抗白血病的蛋鸡新品种。
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