林永 杨汝森 叶菊秀 陈晓燕
作者单位：温州医科大学附属眼视光医院 眼视光学和视觉科学国家重点实验室，温州 325027
葡萄膜黑色素瘤（Uveal melanoma，UM）是一种起源于成人眼内葡萄膜黑色素细胞的恶性肿瘤[1]。国内的UM发病率和死亡率仅次于视网膜母细胞瘤，位居眼内恶性肿瘤第2位。其恶性程度高，50%的UM患者可经血液转移至肝脏、皮肤、肺等部位，转移后致死率极高[2]。但目前其发病机制尚不清楚。
MicroRNA（miRNA）是一类长度为20～24 个核苷酸的非编码单链小RNA，它通过与目标基因的mRNA 3" 非编码区域（3" untranslated region，3" UTR）结合抑制其翻译和表达[3]。有文献报道，miRNA参与调控许多生理和病理过程，如胚胎发育[4]、视网膜发育[5]、衰老[6]和心脏疾病[7]等。有研究发现microRNA在肿瘤的发生发展中也具有重要的调控作用，它通过抑制靶基因的表达来发挥对肿瘤抑制或促进作用[8]。本课题组前期研究发现多个miRNA，如miR-34a[9]、miR-137[10]、miR-182[11]、miR-124a[12]、miR-142-3p[13]、miR-127[14]在UM中表达水平明显下调，对UM细胞的增殖和迁移具有重要的调控作用。这些研究均表明microRNAs是UM发生发展的重要调控因子。
microRNA-135（miR-135）家族包含miR-135a和miR-135b这2个高度同源体。2个同源体具有相同的种子序列，预示miR-135a/b可能具有相同的靶基因和作用途径。本研究主要检测miR-135a/b在人UM中的表达水平变化，探索miR-135a/b对UM细胞迁移的调控作用和机制，为临床上抑制UM转移率提供靶向药物参考。
1.1 材料
1.1.1 细胞 人眼UM细胞M23由美国纽约医学院胡诞宁教授惠赠；
人眼UM细胞SP6.5由加拿大魁北克免疫学研究中心提供；
HEK293细胞购于美国标准生物品收藏中心（ATCC）细胞库。
1.1.2 组织标本 3对UM组织由温州医科大学附属眼视光医院提供，肿瘤组织为实验组，其对应的癌旁组织为对照组。该研究已通过温州医科大学附属眼视光医院伦理委员会审核批准（批号：温医大眼视光伦审2022研第102号），并获得患者及家属知情同意。
1.2 实验试剂
胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）、Dulbecco"s Modified Eagle Medium（DMEM）培养基均购于美国GIBICO公司；
0.05%胰酶、转染试剂（LipofectamineTMRNAi/MAX Reagent）均购于美国Invitrogen公司；
miRNA mimics及其阴性对照购于美国Ambion公司；
小干扰RNA（Small interference RNA，siRNA）购于广州市锐博生物科技有限公司；
抗体SIRT1、β-肌动蛋白（β-ACTIN）均购于美国Cell Signaling Technology公司。双萤光素酶报告实验试剂盒（Dual Luciferase Reporter Assay System）购于美国Promega公司；
硝酸纤维素膜购于美国GE Healthcare公司；
实时定量PCR试剂购于美国ABI公司。
1.3 实验方法
1.3.1 RNA提取和荧光定量RT-PCR 用Trizol法提取细胞或组织中的Total RNA，采用Nano Drop One检测RNA的纯度和浓度。每个样品取20 ng total RNA加入到ABI High Capacity cDNA Archive Kit配制的逆转录反应体系中，放入PCR仪进行逆转录反应（25 ℃温育30 min；
42 ℃温育30 min；
85 ℃变性5 min）。取1 μl逆转录产物，加入10 μl的2×PCR master mix和1 μl Taqman Assay Mix探针，混合均匀，进行荧光定量PCR反应（95 ℃预变性10 min；
95 ℃变性30 s和60 ℃延伸1 min，共进行40个循环）。实验结果按照-ΔΔCt法进行相对表达水平的计算分析。以U6作为内参。
1.3.2 细胞培养 人UM细胞（M23 和SP6.5）、HEK293的培养基为含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的DMEM。将细胞置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养，每隔1天换1次培养液，培养至对数生长期时用于后续实验。
1.3.3 microRNA和siRNA转染细胞 将M23、SP6.5 接种于12 孔板中，待细胞长至融合度为30%～40%时，每孔加入用基础培养液稀释的Lipofectamine RNAi/MAX和microRNA mimics/siRNA（终浓度为50 nmol/L）混合液。转染8 h后更换细胞培养液，继续培养用于后续实验。同时，转染无义miRNA序列（Negative control,NC）或者无义siRNA序列（siRNA negative control,siNC）作为阴性对照组。microRNA mimics和siRNA及其阴性对照的序列见表1。
表1.miRNA mimics和siRNA的序列Table 1.Sequences of miRNA mimics and siRNA
1.3.4 划痕实验 将细胞接种于6孔板生长至融合度为100%时，在孔板中央位置标记划痕，100倍显微镜下拍照记录迁移前细胞面积。细胞培养基中降低血清浓度至0.1%，继续培养24 h。显微镜下观察细胞迁移情况，拍照记录划痕位置（迁移后面积）。采用生物学软件Image J分析细胞迁移的距离。迁移距离相对值=（迁移前细胞面积-迁移后细胞面积）/迁移前细胞面积×100%。
1.3.5 Transwell实验 将细胞接种于6 cm平皿，培养至对数生长期时用0.05%的胰酶消化收集并计数。取3×104个细胞接种于Transwell小室内，上室加入低浓度血清培养基，下室加入完全培养基，置于37℃、5% CO2培养箱中培养，让细胞进行自由迁移。24 h后弃去上室和下室中的培养基，加入4%多聚甲醛溶液室温固定细胞30 min。固定结束后，加入1%结晶紫染色5～10 min，用棉花签拭去小室上层的细胞，保留小室下面穿膜的细胞。倒置相差显微镜下随机选取5个视野拍照，记录穿膜的细胞。实验重复3次。
1.3.6 双萤光素酶报告实验 将包含miR-135a/b结合位点的SIRT1 mRNA 3" UTR片段插入pMIRREPORT 质粒载体构建野生型重组子，命名为SIRT1-WT。将结合位点经过点突变的SIRT1 mRNA 3" UTR片段插入pMIR-REPORT质粒载体构建突变型重组子，命名为SIRT1-MUT。将重组质粒与miR-135a/b mimics或阴性对照（Negative control，NC）共同转染至对数生长期的HEK293细胞，培养48 h后按照Promega公司的双萤光素酶报告实验试剂盒的方法进行检测。
1.3.7 Western blot检测蛋白表达水平 将RIPA裂解液加入培养的细胞中进行裂解，离心去除细胞碎片和其他杂质，取10 μl裂解样品与上样缓冲液混合，沸水浴变性5 min后进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳完成后，将凝胶中的蛋白条带转移至硝酸纤维素膜上，再用5%脱脂牛奶封闭液封闭3 h。封闭后的膜依次进行SIRT1抗体和二抗的孵育，在Odyssey红外激光成像仪上条带成像。
1.3.8 慢病毒载体过表达SIRT1 委托上海吉凯基因医学科技股份有限公司将SIRT1基因表达序列插入慢病毒载体构建为重组的过表达慢病毒载体，命名为Lv-SIRT1。同时构建插入了无义序列的重组慢病毒载体作为NC，命名为Lv-NC。将Lv-SIRT1或者Lv-NC稀释使感染复数（Multiplicity of infection，MOI）达到10并加入对数生长期的细胞培养液中，12 h后更换新培养液。感染3～4 d后，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况以评估慢病毒载体的感染效率。待细胞生长至100%融合度时，收集细胞重新接种于孔板中培养，用于后续实验。
1.4 统计学方法
实验研究。采用SPSS 20.0统计软件进行分析。数据符合正态分布且方差齐，采用表示。组间各数据比较采用独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 miR-135a/b在UM中的表达水平
与癌旁组织相比，UM组织中miR-135a的表达水平下调约20倍（t=6.38，P=0.003），miR-135b的表达水平下调约30倍（t=23.26，P<0.001）。
2.2 miR-135a/b抑制UM细胞的迁移
与NC组相比，miR-135a/b转染的M23和SP6.5细胞的miR-135a或miR-135b表达水平明显升高（miR-135a：t=11.16、15.59，P<0.001;miR-135b：t=15.46、10.48，P<0.001），表明在UM细胞中成功过表达miR-135a和miR-135b。细胞划痕实验结果显示，与NC组相比，miR-135a/b转染的M23 和SP6.5 细胞迁移距离明显减小且差异有统计学意义（miR-135a：t=36.01，P<0.001；
t=8.98，P=0.003；
miR-135b：t=27.53，P<0.001；
t=10.51，P=0.002），见图1A。Transwell实验结果显示，M23和SP6.5细胞中miR-135a/b转染组与NC组相比，其迁移细胞的数量明显减少且差异有统计学意义（miR-135a：t=7.04、7.02，P<0.001；
miR-135b：t=5.01、7.32，P<0.01），见图1B。
2.3 miR-135a/b靶向SIRT1 mRNA 3" UTR调控SIRT1蛋白表达水平
利用miRNA靶基因预测网站Targetscan（http://www.targetscan.org/）对miR-135a和miR-135b的靶基因进行预测和筛选，发现miR-135a和miR-135b的种子序列与SIRT1 mRNA 3" UTR中一段序列高度配对，见图2A。将miR-135a/b在细胞中过表达后，Western blot的结果显示M23细胞中转染miR-135a/b组比NC组SIRT1 蛋白的表达水平明显下调且差异有统计学意义（miR-135a：t=9.93，P<0.001；
miR-135b：t=4.66，P=0.006），转染miR-135a/b的SP6.5细胞中SIRT1 蛋白的表达水平也比NC组的明显下调且差异有统计学意义（miR-135a：t=4.13，P=0.002；
miR-135b：t=6.20，P<0.001），见图2B。采用双萤光素酶报告实验验证miR-135a/b是否能与其靶基因SIRT1 mRNA 3" UTR直接结合，结果显示在转染了重组子SIRT1-WT的HEK293 细胞中，miR-135a/b 组较NC组的萤光素酶荧光值被明显抑制且差异有统计学意义（miR-135a:t=2.88，P=0.028；
miR-135b:t=4.99，P=0.003），见图2C。反之，转染了SIRT1-MUT的HEK293细胞中，miR-135a/b组较NC组的萤光素酶荧光值无差异（miR-135a: t=1.165，P=0.288；
miR-135b:t=1.387，P=0.215），见图2C。
图1.miR-135a/b抑制葡萄膜黑色素细胞的迁移A：划痕实验检测miR-135a/b对M23、SP6.5 细胞迁移能力的影响；
B：Transwell实验分析miR-135a/b对M23、SP6.5细胞迁移能力的影响（标尺=100 μm）Figure 1.miR-135a/b inhibited the migration of uveal melanoma cellA: The effect of miR-135a/b on the migration of M23 or SP6.5 was determined by scratch experiment;B: The effect of miR-135a/b on the migration of M23 or SP6.5 was determined by Transwell assay (bar=100 μm).
图2.miR-135a/b靶向结合SIRT1 mRNA 3" UTRA：miR-135a/b与SIRT1 mRNA 3" UTR的结合位点；
B：过表达miR-135a/b抑制SIRT1蛋白的表达水平；
C：双萤光素酶报告实验验证miR-135a/b靶向结合SIRT1 mRNA 3" UTR。a，与NC组比较，P<0.05；
b，与NC组比较，P<0.01Figure 2. miR-135a/b targeted combined to SIRT1 mRNA 3" UTRA: The binding site of miR-135a/b with SIRT1 mRNA 3" UTR;B: The over expression of miR-135a/b inhibited the protein expression level of SIRT1;C: Dual-Luciferase reported assay was used to confirm the binding of miR-135a/b with SIRT1 mRNA 3" UTR.a,compared with negative control (NC)group,P<0.05;b,compared with NC group,P<0.01.
2.4 下调的SIRT1抑制UM细胞的迁移
Western blot结果显示转染后UM细胞中的SIRT1 蛋白表达水平被下调了90%，见图3A。进一步采用划痕实验和Transwell检测细胞迁移能力。划痕实验结果显示，与NC组相比，SIRT1 siRNA转染组的M23 细胞的迁移距离明显小于NC组且差异有统计学意义（siSIRT1-I：t=13.88，P=0.001；
siSIRT1-II：t=31.20，P<0.001），SP6.5细胞具有一致的结果（siSIRT1-I：t=11.78，P<0.001；
siSIRT1-II：t=6.27，P=0.008），见图3B。Transwell检测结果显示，转染miR-135a/b的M23细胞迁移数量较NC组明显减少且差异有统计学意义（siSIRT1-I：t=7.57，P<0.001；
siSIRT1-II：t=5.58，P=0.002），SP6.5 细胞具有一致的结果（siSIRT1-I：t=4.66，P=0.002；
siSIRT1-II：t=3.25，P=0.011），见图3C。
图3.下调的SIRT1抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的迁移A：SIRT1 siRNA抑制M23和SP6.5细胞中SIRT1蛋白表达水平；
B：划痕实验检测下调的SIRT1抑制M23和SP6.5细胞的迁移；
C：Transwell实验检测下调的SIRT1抑制M23和SP6.5细胞迁移（标尺=100 μm）Figure 3.Down regulation of SIRT1 inhibited the migration of uveal melanoma cellsA: The expression of SIRT1 in uveal melanoma cells M23 and SP6.5 after SIRT1 siRNA transfection;B: The effect of SIRT1 knockdown on the migration of M23 or SP6.5 was determined by scratch experiment;C:The effect of SIRT1 knockdown on the migration of M23 or SP6.5 was determined by Transwell assay (bar=100 μm).
2.5 过表达SIRT1可减弱miR-135a/b对UM细胞迁移的抑制作用
miR-135a/b+Lv-SIRT1 感染组M23 和SP6.5细胞中的SIRT1 蛋白表达水平明显高于miR-135a/b+Lv-NC感染组，差异有统计学意义（miR-135a+Lv-SIRT1：t=7.57，P=0.002；
t=4.58，P=0.011;miR-135b+Lv-SIRT1：t=14.87，P<0.001；
t=4.39，P=0.012），见图4A。Transwell实验结果显示，miR-135a/b+Lv-SIRT1感染组M23 和SP6.5 细胞的迁移数量多于miR-135a/b+Lv-NC感染组，差异有统计学意义（miR-135a+Lv-SIRT1：t=4.10，P=0.003；
t=2.75，P=0.025；
miR-135b+Lv-SIRT1：t=2.99，P=0.018；
t=2.49，P=0.037），见图4B。
miR-135家族包括miR-135a和miR-135b这2个高度同源体，在多种肿瘤中都显示表达水平异常。miR-135a在结直肠癌[15]、乳腺癌[16]、肝癌[17]中的表达水平均显著升高；
但在卵巢癌[18]、胰腺癌[19]、骨肉瘤[20]中的表达水平却明显下调。miR-135b在非小细胞肺癌[21]、胃癌[22]中表达水平明显升高。目前，关于miR-135a/b在UM中的表达水平是否有异常的研究鲜见报道。本研究在UM组织中检测到miR-135a/b表达显著下调，提示miR-135a/b具有抑制UM的作用。过表达miR-135a/b能够抑制UM细胞的迁移能力，提示miR-135a/b在UM的发生发展中发挥着重要的调控作用。有研究报道，肿瘤组织中的转录因子和长链非编码RNA可调控miR-135a的转录，从而引发异常的表达水平[23]。在UM中，对miR-135a/b的转录调控仍有待深入的研究。
图4.过表达SIRT1可减弱miR-135a/b对葡萄膜黑色素细胞的迁移抑制作用A：M23和SP6.5细胞中慢病毒过表达SIRT1蛋白；
B：Transwell检测上调的SIRT1促进M23、SP6.5的细胞迁移（标尺=100 μm）Figure 4.Over expression of SIRT1 suppressed the inhibition effect of miR-135a/b on the migration of uveal melanoma cellsA: The lentivirus overexpressed SIRT1 protein in M23 and SP6.5 cells;B: Transwell assay detected the promotion of cell migration caused by overexpression of SIRT1 in M23 and SP6.5 (bar=100 μm).
miRNA是通过结合靶基因的mRNA 3" UTR来抑制下游蛋白翻译和表达，从而改变下游各种信号调控途径，进而影响细胞的各种生物学进程。有研究表明，miR-135a/b亦是通过抑制其下游靶基因的蛋白翻译和表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，最终形成对肿瘤的调控作用。Chen等[24]研究表明，miR-135a靶向BMI1 和KLF4 抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭，从而控制肿瘤细胞向肺部转移；
Hu等[25]发现，miR-135b靶向大肿瘤抑制激酶2（Large tumor suppressor kinase 2，LATS2）调控皮肤黑色素瘤细胞的增殖和迁移。本研究发现，在UM细胞中miR-135a和miR-135b通过与SIRT1 mRNA 3" UTR靶向结合从而抑制UM细胞的迁移能力。SIRT1是第III类烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）依赖的组蛋白去乙酰化酶，它能调节多种细胞的生物学进程，包括细胞周期、迁移、凋亡、代谢和自噬等[26]。SIRT1在多种肿瘤中高表达，与肿瘤细胞的增殖、迁移密切相关[27]。本课题组的前期研究发现，与正常的UM细胞相比，SIRT1在UM细胞中高表达并促进UM细胞的增殖，敲减SIRT1可以抑制其增殖[28]。本研究中，在UM细胞中过表达miR-135a/b能够抑制SIRT1的蛋白水平表达且抑制UM细胞的迁移能力。下调的SIRT1能否调控UM细胞的迁移能力呢？进一步通过小干扰RNA下调SIRT1 的表达水平也能够明显抑制UM细胞的迁移能力。在过表达miR-135a/b的基础上，上调SIRT1的表达水平能够减弱miR-135a/b对UM 细胞迁移能力的抑制作用。综上所述，miR-135a/b是通过下调靶基因SIRT1的表达水平来发挥其对UM细胞迁移能力的抑制作用。SIRT1在miR-135a/b调控UM细胞迁移能力上具有至关重要的作用，其下游的分子调控机制还需要进一步的探索。
越来越多的研究证明，miRNAs与肿瘤的发生发展密切相关，有望成为新一代药物模式用于癌症的治疗[29-32]。与转移相关的miRNA可通过直接靶向结合具有调控癌细胞迁移、侵袭功能的靶基因来抑制肿瘤转移。miR-135a/b能够靶向结合SIRT1抑制UM细胞的迁移，提示miR-135a/b可用于抑制UM转移的候选靶标分子。
利益冲突申明本研究无任何利益冲突
作者贡献声明林永：参与收集数据，参与选题、设计及资料的分析和解释；
撰写论文；
对编辑部的修改意见进行修改。杨汝森：参与收集数据和实施研究。叶菊秀：参与采集数据和实施研究。陈晓燕：参与选题、设计及资料的分析和解释；
撰写论文；
修改论文中关键性结果、结论，根据编辑部的修改意见进行修改