许琼冠，欧阳一彬，谢镇明
术后认知功能障碍(POCD)是全身麻醉后影响中枢神经系统的常见并发症之一。POCD可延长术后的恢复时间，并长期影响病人的生活质量。60岁以上病人POCD发生率较高，严重影响了老年病人的生活能力和生活质量[1]。有研究表明，年龄增加、大手术、心肌梗死史、酒精依赖史、既往存在认知功能障碍为POCD的独立危险因素[2]。虽然POCD发病机制尚未明确，先前研究表明，炎症反应、氧化应激、蛋白表达变化、细胞凋亡和中枢胆碱能系统的退化可能是POCD发病的因素[3-4]。迫切需要了解导致POCD的潜在机制，并找到有效的方法保护术后认知功能。酪氨酸激酶2(JAK2)/转录激活因子3(STAT3)通路参与较多生理过程，包括炎症、增殖、分化和发育[5]，可能有助于驱动暴露于细胞因子后神经元的存活反应。有研究证实，JAK2/STAT3通路参与了短暂性局灶性脑缺血后的抗凋亡过程[6]。阿尔茨海默病动物模型中，激活JAK2/STAT3通路改善了空间学习和记忆功能[7]。MicroRNA(miRNA)是一类短链非编码RNA，通过mRNA降解或翻译在抑制靶基因表达中发挥关键作用。目前，在哺乳动物的脑组织中发现了大量的miRNA，其与脑组织发育、神经元分化和高级神经功能(如学习和记忆)有关[8]，同时与神经退行性疾病、精神障碍和脑肿瘤等疾病有关[9]。相关研究显示，在阿尔茨海默病和帕金森病中，miRNA参与调节神经元细胞周期控制和凋亡[10]，同时参与调节缺血后脑损伤的病理过程[11]。miR-433位于12号染色体上，有研究显示，miR-433在缺氧条件下可调节神经元的增殖和迁移[12]，提示miR-433在调节神经细胞生物学功能方面具有重要作用。miR-433在POCD的神经发病机制中的作用尚未明确。本研究探讨miR-433和JAK2/STAT3信号通路在大鼠术后认知障碍中的确切作用和相关机制。
1.1 实验试剂与仪器 SYBR Premix Ex Taq试剂盒(北京优尼康生物科技有限公司)；
PrimeScript RT Reagent Kit试剂盒、miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒[宝日医生物技术(北京)有限公司]；
原位末端凋亡(TUNEL)染色试剂盒(Roche公司)；
ABI 7500聚合酶链式反应(qPCR)系统(Applied Biosystems公司)；
BX51显微镜(奥林巴斯公司)。
1.2 实验动物 8周龄雄性SD大鼠，体质量500～600 g，饲养于动物房中(由海南医学院实验动物中心提供)，温度为22～24 ℃，湿度为55%～65%，光照/黑暗周期为12 h，并提供食物和水。所有实验方案和程序均获得医院动物伦理委员会批准。
1.3 POCD大鼠模型的建立和实验分组 将大鼠随机分为Control组、POCD组、POCD+NC mimic组、POCD+miR-433 mimic组。术前禁食12 h，大鼠吸入异氟醚(1.5%～2.0%)麻醉，进行气管插管和机械通气。整个手术过程中暴露在21%O2、79%N2和1.5%～2.0%异氟醚的混合物中进行麻醉。消毒后，在剑突下缘垂直切开3 cm，解剖左肝叶。探查左肝叶并与根部结扎，随后切除。使用0.25%布比卡因浸润切口，3-0缝线缝合。待大鼠恢复意识后，将其送回到动物房。一旦建立大鼠POCD模型，POCD+NC mimic组、POCD+miR-433 mimic组、POCD+miR-433 mimic+Vector组和POCD+miR-433 mimic+pcDNA-JAK2组大鼠分别通过脑室注射将总体积为 2 μL的NC mimic、miR-433 mimic及Vector、pcDNA-JAK2慢病毒注射到海马中。Control组和POCD组大鼠未接受病毒载体。
1.4 方法
1.4.1 莫里斯水迷宫实验(Morris) 使用Morris水迷宫实验评估认知功能。于损伤后5～8 d进行，训练持续4 d，每日5次实验。迷宫由一个不锈钢圆形水池(直径120 cm，高50 cm)组成，将水池分为4个象限，在西南象限的中央放置一个透明的有机玻璃平台。将大鼠从4个象限中的一个放入水中自由游泳，探索迷宫，直至找到平台。若大鼠在60 s内找不到平台，将其放置在平台上休息10 s。第5天，移除平台，将大鼠从东北象限放入水中，让其游泳60 s，记录大鼠逃避潜伏期、穿越平台次数。
1.4.2 苏木精-伊红(HE)染色 使用35 mg/kg戊巴比妥钠麻醉大鼠，解剖大鼠分离脑组织样本。将脑组织置入4%多聚甲醛中固定24 h，进行常规石蜡包埋。将组织切成厚度为5 μm的连续冠状切片，之后脱蜡再水合。使用HE染色试剂盒对脑组织进行染色，在光学显微镜下观察脑组织病理变化。
1.4.3 TUNEL染色 按照制造商说明书，使用TUNEL染色试剂盒进行染色。将切片与包括TdT酶和TMRred标记的dUTP在内的TUNEL反应混合物在37 ℃下避光孵育1 h，之后洗涤15 min，使用含有0.03%的3，3′-二氨基联苯胺(DAB)的转化过氧化物酶可视化。在BX51显微镜下观察和计数每个切片的5个视野下TUNEL阳性细胞总数。
1.4.4 实时荧光定量PCR(RT-qPCR) 使用Trizol试剂从海马组织中提取总RNA。之后用PrimeScript RT Reagent Kit试剂盒和miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒分别从mRNA和miRNA中反转录合成cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq试剂盒在ABI 7500 qPCR系统上进行PCR反应。反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，重复40个循环。采用2-ΔΔCt法计算miRNA和mRNA基因的相对表达，U6和GAPDH分别作为miRNA和mRNA的内部对照。
1.4.5 酶联免疫吸附(ELISA)实验 收集海马组织，采用RIPA法分离蛋白，采用二喹啉甲酸法(BCA)试剂盒测定蛋白浓度。根据ELISA试剂盒说明书检测超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平，使用酶标仪测量450 nm波长各孔的吸光度值。
1.4.6 蛋白免疫印迹法(Western Blot) 使用RIPA裂解液对处理后的海马组织进行分裂，采用BCA试剂盒检测蛋白浓度。将50 g蛋白样品通过8%～12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。将膜在含5%脱脂牛奶的PBST缓冲液中于37 ℃封闭1 h，并与一抗在4 ℃下孵育过夜。之后将膜与相应的辣根过氧化物酶结合的二抗在37 ℃下孵育1 h。使用电化学发光(ECL)试剂盒测量相关蛋白表达水平，并使用Image J软件进行定量。
1.4.7 双荧光素酶报告基因实验 将293 T细胞接种在24孔板中，并与携带野生型JAK2(WT-JAK2)或突变型JAK2(MUT-JAK2)的荧光素酶质粒和miR-433 mimic或NC mimic共转染。孵育48 h后，根据说明书采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光强度。
2.1 miR-433对POCD大鼠认知能力的影响 与Control组比较，POCD组大鼠海马组织中miRNA-433表达降低，逃避潜伏期延长，穿越平台次数减少；
与POCD+NC mimic组比较，POCD+miR-433 mimic组大鼠海马组织中miRNA-433表达升高，逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图1。
POCD组与Control组比较，＊P<0.05；
POCD+miR-433 mimic组与POCD+NC mimic组比较，#P<0.05。图1 miR-433对POCD大鼠认知功能的影响(A为miRNA-433表达柱状图；
B为逃避潜伏期柱状图；
C为穿越平台次数柱状图)
2.2 miR-433对POCD大鼠海马组织病理学的影响 HE染色结果显示：Control组海马组织神经细胞排列规则紧密，细胞边界清晰，细胞核呈圆形或椭圆形。POCD组神经细胞紊乱，细胞核溶解，海马神经元细胞和锥体细胞死亡，坏死神经细胞数量减少。POCD+miR-433 mimic组大鼠海马内细胞排列较POCD+NC mimic组更规则，坏死神经细胞数量减少。详见图2。
图2 miR-433对POCD大鼠海马组织病理学变化的影响(HE)
2.3 miRNA-433过表达对神经元细胞凋亡的影响 与Control组比较，POCD组大鼠神经元细胞凋亡率、Cleaved Caspase-3和Bad蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低；
与POCD+NC mimic组比较，POCD+miR-433 mimic组大鼠神经元细胞凋亡率、Cleaved Caspase-3和Bad蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图3。
POCD组与Control组比较，＊P<0.05；
POCD+miR-433 mimic组与POCD+NC mimic组比较，#P<0.05。图3 miR-433对POCD大鼠神经元细胞凋亡的影响(A为TUNEL染色图；
B为细胞凋亡率柱状图；
C为各蛋白表达条带图；
D为各蛋白表达柱状图)
2.4miRNA-433过表达对POCD大鼠海马组织氧化应激水平的影响 与Control组比较，POCD组大鼠海马组织SOD水平降低，MDA水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；
与POCD+NC mimic组比较，POCD+miR-433 mimic组大鼠海马组织SOD水平升高，MDA水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图4。
POCD组与Control组比较，＊P<0.05；
POCD+miR-433 mimic组与POCD+NC mimic组比较，#P<0.05。图4 miR-433对POCD大鼠海马组织氧化应激水平的影响 (A为MDA表达柱状图；
B为SOD表达柱状图)
2.5 miR-433靶向JAK2并调控其表达 双荧光素酶报告基因实验结果显示，与NC mimic组比较，miR-433 mimic组WT-JAK2细胞荧光素酶活性降低(P<0.05)；
RT-qPCR实验结果显示，与NC mimic组比较，miR-433 mimic组JAK2 mRNA和蛋白水平下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图5。
与NC mimic组比较，＊P<0.05。图5 miR-433靶向JAK2并调控其表达(A为荧光素酶活性柱状图；
B为JAK2 mRNA表达柱状图；
C为JAK2蛋白表达条带图；
D为JAK2蛋白表达柱状图)
2.6 miR-433通过JAK2/STAT3通路对POCD大鼠氧化应激和凋亡的影响 与POCD+NC mimic组比较，POCD+miR-433 mimic组大鼠海马组织中p-JAK2、p-STAT3、Cleaved Caspase-3、Bad蛋白及MDA水平降低，Bcl-2蛋白、SOD水平升高；
与POCD+miR-433 mimic+Vector组比较，POCD+miR-433 mimic+pcDNA-JAK2组大鼠海马组织p-JAK2、p-STAT3、Cleaved Caspase-3、Bad蛋白及MDA水平升高，Bcl-2蛋白、SOD水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图6。
POCD+miR-433 mimic组与POCD+NC mimic组比较，＊P<0.05；
POCD+miR-433 mimic+pcDNA-JAK2组与POCD+miR-433 mimic+Vector组比较，#P<0.05。图6 miR-433通过JAK2/STAT3通路对POCD大鼠氧化应激和凋亡的影响(A为各蛋白表达条带图；
B为Cleaved Caspase-3、Bad、Bcl-2蛋白表达柱状图；
C为p-JAK2、p-STAT3蛋白表达柱状图；
D为MDA表达柱状图；
E为SOD表达柱状图)
POCD主要临床表现为注意力、记忆、语言等认知功能减退。POCD的病理机制复杂，且尚未明确。在具有学习和记忆功能的大脑海马体中，信号通路的改变认为是全身麻醉导致POCD认知障碍的上游机制。据报道，异氟醚是一种常见的吸入麻醉剂，通过核转录因子(NF)-κB和缺氧诱导因子-1等多种途径诱导老年大鼠海马神经炎症和认知损伤[13]。氧化应激可能参与POCD的发病机制，有研究显示，手术创伤诱导了POCD模型鼠海马的氧化应激[14]。这些机制为POCD提供了潜在的预防或治疗靶点。已研究证实，在POCD大鼠模型中，抑制氧化应激可改善认知功能障碍[15]。本研究采用异氟醚诱导的大鼠POCD模型，通过测定氧化应激因子、细胞凋亡和JAK2/STAT3信号通路相关蛋白，探讨miR-433在大鼠POCD发生和进展中的作用，本研究提供了一种新的POCD治疗方法，并探讨其作用机制。
Morris水迷宫实验常用于评估大鼠认知功能，主要是实验动物空间位置和方向学习记忆能力，广泛应用于学习记忆、老年痴呆、海马研究、智力与衰老、新药研发等方面的研究[16]。逃逸潜伏期用于评估大鼠学习能力，逃逸潜伏期越短，表现越好。穿越平台次数用于评估空间记忆能力，穿越平台次数越多提示性能水平越高。本研究将miR-433过表达腺病毒注射至大鼠体内，结果显示，miR-433过表达改善了POCD大鼠学习和空间记忆能力。
本研究结果显示，miR-433过表达与海马MDA降低和SOD水平升高有关，表明miR-433过表达抑制了老年POCD大鼠海马的氧化应激。氧化应激是指抗氧化防御系统功能障碍，导致活性氧和活性氮过量产生，从而导致组织和细胞损伤[17]。SOD是抗氧化系统中重要的酶，其活性可直接反映线粒体抗氧化系统水平[18]。有研究表明，氧化应激参与了POCD诱导的神经元损伤[1]。有研究显示，手术创伤可诱导POCD海马氧化应激，从而参与POCD发病机制，年龄也是POCD的危险因素，年老的海马表现出多种神经生物学变化，包括氧化应激增加[19]。因此，氧化应激可能是治疗POCD的潜在靶点。有研究表明，miR-7684参与调控POCD氧化应激的表达[20]。本研究中，miR-433过表达可降低POCD大鼠氧化应激，抑制神经元凋亡，改善术后认知功能障碍的发生和发展，发挥神经保护作用。
相关研究显示，JAK2/STAT3信号通路在脑缺血神经元中具有抗炎和抗凋亡作用[21]。JAK2磷酸化或过表达可能是脑损伤的机制之一[22]。减少JAK2/STAT3磷酸化可减少神经元死亡，缩小梗死面积，防止神经细胞缺血后损伤。脑缺血后通过RNA干扰降低了STAT3磷酸化，具有显著的神经保护作用[23]。有研究显示，电针刺激大鼠局灶性脑缺血，通过降低JAK2表达，防止JAK2异常激活，下调STAT3磷酸化，从而改善神经功能缺损[24]。JAK2/STAT3通路下调与miRNA上调相关。miR-17通过靶向JAK2/STAT3信号通路，减少胶原诱导关节炎小鼠的炎症和骨侵蚀[25]。有研究显示，帕金森病和阿尔茨海默病病人miR-433下调，miR-433过表达可能通过JAK2/STAT3降低Aβ诱导的神经元活性抑制[26]。miR-433通过JAK2/STAT3通路在术后认知障碍中的作用尚未明确。本研究结果显示，miR-433过表达可能通过JAK2/STAT3通路改善大鼠POCD。
综上所述，miR-433通过JAK2/STAT3通路调控氧化应激抑制海马组织的神经元凋亡，改善大鼠认知功能，为治疗POCD提供了新方法。
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