龚赛赛，张 朝，全楚娴，周诗萌，高 兴，曾智博，曹 晖，李家奎,2*
(1.华中农业大学动物医学院，湖北武汉 430070；
2.西藏农牧学院动物科学学院，西藏林芝 860000；
3.陕西秦宝牧业股份有限公司，陕西宝鸡 721000)
犊牛腹泻是犊牛期的一种消化系统疾病，其主要临床表现为排稀薄或水样粪便，呈黄色、绿色或白色，有恶臭，甚至含有黏膜或便血等，且传染性强，给养牛行业带来巨大的经济损失[1]。引起犊牛腹泻的原因有很多，除了消化不良及饲养管理不当之外，最重要的原因是病原微生物的感染，如大肠埃希氏菌(E.coli)、沙门氏菌(Salmonella)、牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)、牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)、牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)、隐孢子虫(Cryptosporidium)、球虫(Coccidia)等[2-4]。目前，生产上主要使用抗生素防治犊牛腹泻，但抗生素类药物在应用过程中容易产生耐药性，药物残留超标可引起食品安全和公共卫生等问题[5]，我国已禁止生产含有抗生素等促生长类饲料添加剂的商品饲料[6]。因此，寻找和开发新的安全、高效、低毒的抗生素替代品便成为当前研究的热点。传统中草药和新兴益生菌可以调节动物机体肠道菌群，促进活性物质的增殖，提高机体免疫力[7]。研究表明，在犊牛日粮中添加复合益生菌制剂可以显著降低犊牛腹泻率,提高犊牛生长性能[8]。研究发现[9]，早期给予犊牛益生菌可改善犊牛肠道健康，调节肠道菌群，抑制病原体定殖，从而减少腹泻病的发生。中草药不仅具备抗菌消炎及调控机体自身免疫等作用，还具有疗效好、低毒、低残留、环保和不易产生耐药性等优点[10]。研究表明[11]，传统中药复方补中益气汤、四君子汤和参苓白术汤能够缓解抗生素相关性腹泻，改善肠道菌群。用中药蒲公英、黄连、板蓝根等提取物能有效改善猪流行性腹泻病毒所致的新生仔猪生长性能受损和肠道损伤，减轻腹泻[12]。因此,益生菌和中草药替代抗生素应用于畜牧业腹泻疾病的防控受到越来越多学者的关注。本研究以1月龄以内腹泻犊牛为试验对象，探究牦牛源地衣芽孢杆菌和自拟中药复方对犊牛腹泻的影响，为开发用于防控犊牛腹泻的益生菌制剂和中草药复方提供参考依据。
1.1 材料
1.1.1 试验用动物 10日龄至30日龄中度及以上腹泻犊牛20头，健康犊牛5头，腹泻病料及试验犊牛来自陕西省杨凌示范区某肉牛场。
1.1.2 药物和益生菌制剂的准备 自拟中药复方(TCM)及用量(1月龄内犊牛)：干姜(3.75 g)、白术(2.4 g)、山药(3.75 g)、茯苓(2.6 g)、白附片(1.35 g)、丹参(1.15 g)、党参(3.75 g)、虎杖(0.75 g)、佩兰(1.25 g)、泽兰(1.35 g)、川芎(1.25 g)、马尾黄连(0.625 g)、山楂(0.725 g)等中草药用粉碎机打碎成粉按比例混合，加水灌服。牦牛源地衣芽孢杆菌(BL)，华中农业大学李家奎教授团队分离保存，经扩大培养后制成干粉制剂，2.5 g/次(108CFU)溶于水中灌服。
1.1.3 主要试剂 Simply P病毒DNA/RNA 提取试剂盒BSC67M1，杭州博日科技股份有限公司产品；
HiScript Ⅱ One Step RT-PCR Kit (Dye Plus) P612-01，南京诺唯赞生物科技股份有限公司产品；
2×ProTaq预混液(含染料)AG11109，湖南艾科瑞生物工程有限公司产品；
SuperRed/GelRed核酸染料BS354A，北京兰杰柯科技有限公司产品。
1.1.4 主要仪器 台式冷冻离心机，Hettich公司产品；
固定式旋转混匀仪和PCR仪，大龙兴创实验仪器(北京)股份公司产品；
电泳仪，北京六一生物科技有限公司产品;蓝光凝胶成像分析系统，北京百晶生物技术有限公司产品；
全自动生化分析仪，迈瑞公司产品。
1.2 方法
1.2.1 病原检测 收集腹泻犊牛粪便样本，干冰低温条件下运输至实验室，在-80℃保存用于病原检测。用无酶水稀释粪便样本至适宜浓度后1 000 r/min离心4 min，取上清液按照Simply P病毒DNA/RNA提取试剂盒、HiScript Ⅱ One Step RT-PCR Kit (Dye Plus) 、2×ProTaq预混液(含染料)说明提取核酸并进行病原检测，检测病原及扩增引物见表1。扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳后在蓝光凝胶成像分析系统下观察结果。
表1 引物序列
1.2.2 动物分组及处理 健康犊牛5头，中度及以上腹泻犊牛20头，平均分为5个试验组，分别为健康对照组(NC)、腹泻组(DC)、中药复方治疗组(TCM)、牦牛源地衣芽孢杆菌治疗组(BL)、中药复方联合地衣芽孢杆菌治疗组(TCM+BL)。治疗组犊牛给与对应药物，每天2次(早、晚各1次)，加水灌服，连续治疗5 d，每天上午8时对腹泻犊牛进行一次综合评分。第6天上午所有犊牛空腹采集血样，分离血清，置-20℃冻存用于生理生化指标检测。
腹泻犊牛临床评分从粪便状况、精神状况和脱水状况三个方面综合评判，综合评分1分～3分、4分～6分、7分～9分依次判定为轻度腹泻、中度腹泻和重度腹泻。粪便状况评分：粪便正常，形态好(0分)，粪便半成型，比正常粪便软(1分)，伴有水样，但还是有固体成分可见(2分)，完全水样的粪便(3分)；
精神状况评分：正常的行为表现，动物对环境警觉(0分)，轻度抑郁，反应迟钝，但犊牛还能站立和吮吸，不活跃(1分)，中度抑郁，能站立或不愿站立呈爬卧状，吮吸很弱或虚弱(2分)，严重抑郁，犊牛不能站立和吮吸，侧躺不起(3分)；
脱水状况评分：正常，眼睛明亮，皮肤柔顺(0分)，轻度失水，皮肤弹性稍微丧失，皮肤褶皱试验还原时间<3 s，眼球没有凹陷(1分)，中度失水，皮肤褶皱试验还原时间>3 s，眼球凹陷(2分)，重度失水，皮肤褶皱试验还原时间>6 s，眼球明显凹陷(3分)。
1.2.3 血清生化指标检测 采用迈瑞全自动生化分析仪BS-240VET对血清样本进行生化指标检测如丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、钙(Ca)、镁(Mg)、尿素(UREA)、无机磷(P)。
2.1 腹泻病原PCR检测结果
在18份腹泻犊牛粪便样本中检测出BRV阳性样本11份，阳性率为61.11%；
BCoV阳性样本12份，阳性率66.67%；
BVDV未检测出阳性。以上结果表明，该场区犊牛腹泻主要是由BRV和BCoV感染引起的(表2)。
表2 腹泻犊牛病原检测
2.2 腹泻犊牛临床评分变化
与腹泻组相比，各治疗组犊牛临床评分均表现下降趋势，且TCM+BL组的犊牛临床评分降低程度最大，经过5 d的治疗后评分趋近于0。TCM组犊牛的临床评分降低程度要高于BL组犊牛(图1)。以上结果表明中药和地衣芽孢杆菌能降低腹泻犊牛的临床评分改善犊牛腹泻程度，中药和地衣芽孢杆菌联合使用其降低腹泻犊牛临床评分的能力要高于单一使用。
图1 腹泻犊牛每日临床评分
2.3 血清生化指标变化
与NC组相比，DC组犊牛血清中TP、ALB、ALP、ALT、AST、UREA的浓度较高且差异显著(P<0.05)，血清Ca2+、P-、Mg2+的浓度较低且差异显著(P<0.05)。与DC组相比，TCM组、BL组、TCM+BL组犊牛血清的TP、ALB、ALP、ALT、AST、UREA浓度均偏低且差异显著(P<0.05)，血清Ca2+、P-、Mg2+的浓度均偏高且差异显著(P<0.05)。以上结果表明腹泻会引起犊牛血清各生化指标发生异常变化，血清TP、ALB、ALP、ALT、AST、UREA的浓度升高，血清Ca2+、P-、Mg2+的浓度降低，用中药复方和地衣芽孢杆菌进行治疗后能改善或恢复血清生化指标的异常变化(表3)。
表3 犊牛血清生化指标检测
3.1 犊牛腹泻病因分析
BRV通常导致年龄小于3周龄的犊牛腹泻，并通过粪便将病毒排放到环境中引起群体大规模感染[13-14]。BCoV主要引起1周龄～2周龄犊牛的腹泻，在我国普遍存在[15]。崔鑫等[16]研究表明，**南疆部分地区规模化奶牛场BRV的感染率为15.38%,BCoV的感染率为9.54%,2种病毒混合感染率为6.76%。黎玉琼等[17]调查显示宁夏部分地区腹泻犊牛的BRV检出率为43.16%,BCoV的检出率为34.74%。本研究中，实验室病原检测结果显示，在18份腹泻样本中BRV的阳性检出率为66.67%，BCoV的阳性检出率为61.11%，与其他学者的研究结果相似，因此可以推断该场区犊牛腹泻主要是BRV和BCoV混合感染引起的病毒性腹泻病。
3.2 自拟复方和地衣芽孢杆菌对犊牛腹泻的影响
传统中草药和益生菌与抗生素类药物相比,具有不易产生耐药性、低残留甚至无残留的特点,在防控犊牛腹泻性疾病中的优势日益明显。钟秋等[18]以黄连、乌梅、诃子肉、白术等中药制备复方诃子口服液在体外对犊牛大肠埃希氏菌具有良好的抑菌效果,对大肠埃希氏菌腹泻模型小鼠疗效显著。王竹青等[19]用生地、枳壳、丹皮等中药组建复方对牛病毒性腹泻病牛进行治疗，结果表明在牛病毒性腹泻治疗中使用中药复方可有效提高成年牛及犊牛的治疗总有效率。团勇等[20]研究表明饲喂含有枯草芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌的犊牛精料能够显著降低犊牛腹泻发生的概率。研究表明乳杆菌能够改善犊牛粪便评分，降低腹泻发生的概率[21]。本研究中，用自拟中药复方和牦牛源地衣芽孢杆菌治疗后，犊牛腹泻评分呈下降趋势，腹泻程度降低，与其他学者的研究结果一致，表明自拟复方和牦牛源地衣芽孢杆菌对犊牛腹泻具有良好的改善效果。并且，中药复方联合牦牛源地衣芽孢杆菌治疗时，犊牛腹泻程度明显下降，临床症状改善优于单一治疗组，推测中药复方和牦牛源地衣芽孢杆菌之间在治疗犊牛腹泻的过程中可能存在协同作用。
3.3 自拟复方和地衣芽孢杆菌对腹泻犊牛血清生化的影响
血清生化指标能够反映动物机体生理机能及健康状态。腹泻导致的脱水、肠道功能障碍以及其他器官的病理变化会引起动物生化指标的异常变化，与疾病的发生发展和动物机体的临床状况密切相关。
血清TP和ALB的升高常见于严重脱水性疾病，如腹泻。研究表明[22-23]，腹泻会引起血清TP和ALB水平显著升高。在本研究中也得到了相似的结果，DC组犊牛血清TP和ALB水平显著升高，可能是腹泻引起机体严重脱水从而导致血清中TP和ALB的浓度升高。治疗5 d后，治疗组犊牛的血清TP和ALB水平相较于DC组显著降低，并且TCM+BL组犊牛的血清TP和ALB水平更接近NC组水平。试验结果表明自拟中药复方和牦牛源地衣芽孢杆菌可显著降低腹泻引起的血清TP和ALB浓度的升高，改善腹泻犊牛的脱水程度，并且自拟复方和牦牛源地衣芽孢杆菌之间可能存在某种协同机制，联合使用的效果要优于单一效果。
血清中ALT、ALP和AST浓度的变化常见于一些肝脏疾病，当肝脏发生炎症或损伤时，血清中ALT、ALP和AST浓度会急剧升高[24]。本研究中，DC组犊牛血清中ALT、ALP和AST浓度显著升高，提示可能是腹泻或病毒感染等因素引起肝脏炎症或损伤。秦枫等[25]研究表明由地锦草、石榴皮等组成中药复方能有效保护大肠埃希氏菌感染引起的雏鸭肝脏损伤，降低血清ALT、ALP和AST水平。研究表明植物乳杆菌MYS6能改善伏马毒素B1导致的肉鸡肝损伤，显著恢复血清ALT、ALP和AST的活性[26]。本试验中，TCM组、BL组和TCM+BL组犊牛相较于DC组血清ALT、ALP和AST的浓度显著降低，与其他学者的研究结果一致，提示自拟复方和牦牛源地衣芽孢杆菌也具有保护肝脏的效果，能够改善腹泻或病原感染造成的肝功能损伤。
UREA是哺乳动物蛋白质分解代谢的终产物，主要由肾脏排泄，血清UREA偏高常见于肾功能障碍。本研究中，DC组犊牛血清UREA显著偏高，可能是腹泻或病毒感染引起肾脏损伤。TCM组、BL组和TCM+BL组犊牛的血清UREA浓度相较于DC组显著偏低，表明自拟复方和牦牛源地衣芽孢杆菌可能具有保护肾脏改善肾功能的作用。
Ca、P、Mg等血清离子是机体新陈代谢过程中的重要元素，反映了机体代谢平衡和健康状态，其变化可以反映骨组织的代谢情况和某些疾病变化[27,28]。本试验中，DC组犊牛血清离子水平显著降低，可能是腹泻导致消化系统功能障碍，肠道吸收功能下降，造成离子大量流失。与DC组相比，TCM组、BL组和TCM+BL组犊牛血清离子水平显著升高，提示自拟复方和牦牛源地衣芽孢杆菌能调节肠道吸收功能，改善机体离子流失。
本试验结果显示，场区犊牛腹泻主要是BCoV和BRV感染导致。由干姜、白术、山药等中草药组成的复方和牦牛源地衣芽孢杆菌对犊牛腹泻疾病有良好的治疗效果，能减轻腹泻的临床症状，改善或恢复脱水等引起的血清生化指标的变化。自拟中药复方和牦牛源地衣芽孢杆菌之间可能存在某些协同机制还有待进一步研究。
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