马颜雯 李继姬 叶莹莹
狄氏斧蛤()线粒体全基因组测定及结构特征分析*
马颜雯 李继姬 叶莹莹①
(浙江海洋大学 国家海洋设施养殖工程技术研究中心 浙江舟山 316022)
为解析狄氏斧蛤()线粒体全基因组结构特征以及进化地位, 采用二代高通量测序技术获得狄氏斧蛤线粒体基因组全序列, 对线粒体基因进行注释并对其序列结构进行分析。结果表明, 狄氏斧蛤的线粒体全基因组序列全长为16 908 bp, 碱基组成为A (26.81%)、T (41.13%)、G (21.21%)和C (10.85%), A+T含量为67.94%, 表现出明显的AT偏向。与其他双壳贝类相似, 狄氏斧蛤共编码13个蛋白质编码基因, 包含22个tRNA和2个rRNA, 且所有基因均位于H链; 蛋白质编码基因拥有3种起始密码子(ATG、ATT、ATA), 而除了、以及使用TAG作为终止密码子外, 其余所有蛋白质编码基因都使用TAA作为终止密码子。除tRNA不能折叠成典型的三叶草结构, 没有明显的DHU茎环, 其余tRNA都能折叠成典型的三叶草结构。狄氏斧蛤与斧蛤科(Donacidae)其他物种具有相同的基因排列, 未发现基因重排现象。基于线粒体12个蛋白质编码基因构建62种贝类的进化树, 结果显示:和聚为一小支,和聚为一小支, 这四个物种与狄氏斧蛤一起聚为斧蛤科这一支; 进化树支持将斧蛤科划归到樱蛤总科中, 且将樱蛤总科所属的鸟蛤目单独列为一个目而非划归到帘蛤目中。
狄氏斧蛤; 线粒体基因组; 基因重排; 系统发育分析
线粒体是细胞中进行有氧呼吸的主要场所, 为生物体的生命活动提供ATP。由于动物线粒体DNA具有结构简单、母系遗传、进化速率快等特点(董依萌等, 2020), 常被用于解决分类学争议问题、确定隐种(Tong, 2022)、重建系统发生关系(Xu, 2011, 2022)及研究近缘种和种内群体间遗传分化(Breton, 2009; Zbawicka, 2010)等。与基于单个线粒体基因的分析相比, 基于线粒体全基因组的系统发育分析可以提高系统发育树的分辨率和统计置信度(Ingman, 2000; Mueller, 2006; Miao, 2022)。贝类线粒体基因组通常包括13个蛋白质编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和一个非编码控制区(陈复生等, 2003)。无脊椎动物尤其是贝类的线粒体基因组表现出高度变异性, 且是目前已知变异程度最高的类群(徐晓东等, 2009)。此外, 在双壳纲各种属之间, 线粒体基因组在基因结构和基因排列方式等方面也都显示出了极大的多样性(孟学平等, 2013)。到目前为止, 已经发表了不少基于线粒体全基因组的双壳类软体动物系统发育分析研究, 例如, 远洋等(2012)测定了六种异齿亚纲双壳贝类的线粒体全基因组, 并基于线粒体全基因组进行系统发育分析, 构建的系统进化树支持将缢蛏属划归到竹蛏总科而非樱蛤总科; 夏立萍等(2021)等基于等边浅蛤()线粒体全基因组进行系统发育分析, 结果表明等边浅蛤与菲律宾蛤仔亲缘关系最近; 林巧惠(2010)对池碟蚌()线粒体基因组全序列进行了分析, 构建的系统进化树显示池碟蚌与三角帆蚌亲缘关系最近。此外, 线粒体全基因组在腹足纲的系统发育关系的重建中也取得了一定进展, 例如, Miao等(2022)基于蜑螺亚纲(Neritimorpha)线粒体全基因组进行系统发育分析, 发现蜑螺亚纲和Gaenogastropoda具有较近的亲缘关系。Xu等(2022)基于笠形腹足目(Patellogastropoda)线粒体全基因组进行系统发育分析, 构建的系统进化树将笠形腹足目下的Lottioidea分为两个具有高分支支持度的非单系群。
狄氏斧蛤(), 属于鸟蛤目(Cardiida)、樱蛤超科(Tellinoidea)、斧蛤科(Donacidae)、斧蛤属(), 其贝壳表面光滑, 壳表颜色不固定, 一般为浅黄褐色和白灰色, 体型较小近似瓜子, 在亚洲主要分布于越南沿海以及中国东海和南海的潮间带沙滩中(蔡英亚等, 2002), 并且斧蛤属是温带, 热带和亚热带地区沙滩动物的重要组成部分(Ansell, 1983)。但目前国内外对斧蛤科的研究多集中于种群动态分析(Singh, 2017; Tenjing, 2017), 对斧蛤科进行的系统发育研究较少, Fernández-Pérez等(2017)测定了四种雌性斧蛤属贝类线粒体全基因组并基于此进行系统发育分析, 研究结果表明四种斧蛤聚为一支, 形成斧蛤科, 与樱蛤总科中其他四个科构成姊妹群(紫云蛤科、截蛏科、樱蛤科、双带蛤科); 随后Fernández-Pérez等(2018)又对四种斧蛤科贝类的ITS序列进行研究并基于此构建系统发育树, 结果与基于线粒体基因组构建的系统发育树相似。其他相关的系统发育研究则大多集中于斧蛤科所属的樱蛤总科(Bieler, 2006),如于红等(2011)研究了樱蛤总科贝类的线粒体基因组特征并基于线粒体蛋白质编码基因序列构建系统发育树, 进化树分支支持缢蛏属于竹蛏总科, 而不属于樱蛤总科的截蛏科, 并且樱蛤总科下的紫云蛤属不是单系发生; 远洋等(2012)基于线粒体全基因组构建了樱蛤总科和竹蛏总科的六种双壳贝类系统发育树, 结果显示缢蛏()与樱蛤总科下的截蛏科相距较远, 与竹蛏科的大竹蛏()是姐妹群。此外, 于贞贞(2014)还详细研究了樱蛤总科的系统发生学关系, 研究结果显示樱蛤总科是并系或者复系发生的, 且樱蛤总科的缢蛏属与竹蛏总科的刀蛏属显示了较近的亲缘关系, 但具体的分类地位还需要进一步研究。
本研究利用二代高通量技术对狄氏斧蛤的线粒体基因组进行测序, 分析狄氏斧蛤线粒体基因组核苷酸组成、密码子的使用、tRNA的二级结构以及基因重排。同时基于12个蛋白质编码基因(PCGs)对狄氏斧蛤和Imparidentia超目下的61个物种进行系统发育分析, 以了解狄氏斧蛤的系统发育地位。这些研究结果可为鸟蛤目的系统发育关系及进化地位积累有价值的数据资料。
1.1 样品采集和DNA提取
本研究于2018年7月在浙江省舟山市桃花岛塔湾沙滩(122°30’E, 29°82’N)采集了狄氏斧蛤样品, 在无水乙醇中于–20 °C条件下保存。首先通过张素萍(2008)的《中国海洋贝类图鉴》对标本进行初步形态学鉴定。随后使用盐析法(Aljanabi, 1997)提取闭壳肌组织DNA, 1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量, 送样测序前在–20 °C条件下保存。
1.2 线粒体基因组的测序和注释
委托上海元莘生物医药科技有限公司使用二代测序方法(Aljanabi, 1997)对狄氏斧蛤闭壳肌组织DNA样品进行高通量测序。测序前对建好的文库进行质检, 合格后采用Illumina HiSeqTM平台测序。共获得约10 G数据量, 对下机后的数据进行质控, 对低质量读段、重复读段(duplication reads)、N率较高序列及测序接头序列等进行数据过滤, 最终得到高质量的测序数据(Clean data)。利用NOVOPlasty组装软件(Dierckxsens, 2017)对Clean data片段进行组装拼接。得到的叠连群与参考基因和GenBank数据库已有的斧蛤线粒体全长数据进行比对, 得到大部分线粒体基因组序列信息。然后通过在线软件MITOS (http://mitos.bioinf. uni-leipzig.de/index.py)进行结构功能注释, 最终得到完整的线粒体基因结构。
为保证狄氏斧蛤物种的准确性和序列的正确性, 使用NCBI BLAST对其进行分类鉴定(Altschul, 1997)。而后利用在线软件MITOS确定狄氏斧蛤线粒体蛋白质编码基因的数量及其起始和终止密码子的位置。环状基因组可视化利用CGView服务器(http://cgview.ca/)。利用在线软件MITOS对转运RNA (tRNA)及核糖体RNA (rRNA)进行注释, 并识别其tRNA的数量和二级结构, 而后使用Adobe Photoshop CC软件进行编辑(Zuker, 2003)。利用MEGA 7.0 (Kumar, 2016)计算各蛋白质编码基因的核苷酸组成和相对同义密码子使用(relative synonymous codon usage, RSCU)。AT和GC偏斜值计算公式如下(Hassanin, 2005): AT-skew=(A–T)/(A+T)和GC-skew=(G–C)/(G+C)。
1.3 系统发育进化树构建
为了分析斧蛤科贝类的系统发育关系, 本研究从GenBank中下载Imparidentia超目下的61个物种线粒体全序列, 以大脐鹦鹉螺(, NC007980)和圆鲍螺(, NC056350)的线粒体基因组全序列为外群, 由于部分物种如文蛤等缺少基因, 所以使用软件MEGA7.0将64个物种的12个编码基因(除外)分别信息序列比对和分析(Kumar, 2016), 将所有物种的蛋白质编码基因串联成一个大的数据集, 使用软件MEGA7.0进行序列比对和修剪, 利用多序列比对的结果, 基于最大似然法(ML)和贝叶斯推理(BI)进行系统发育分析构建系统发育树。本研究所使用的线粒体基因组具体信息见表1。
首先将比对好的数据导入IQ-TREE运行程序中, 进行卡方检验, 随后使用ModelFinder自动计算筛选最佳替换模型(TVM+F+R6)构建ML树(Nguyen, 2015; Kalyaanamoorthy, 2017)。使用MrBayes v3.2(Ronquist, 2012)程序进行贝叶斯分析, 结合MrMTgui中的PAUP 4.0、Modeltest 3.7和MrModeltest 2.3软件, 根据AIC信息准则(Posada, 1998; Swofford, 2002)选择最适合的替代模型(GTR+I+G)构建BI树。BI分析基于MCMC (Markov Chain Monte Carlo)抽样法, 每1000代抽样一次, 共运行200万代, 初始25%的采样数据作为老化数据丢弃, 最终得到一致树并计算后验概率(Posterior Probability, PP)。最后使用软件FigTree v1.4.3和Adobe Photoshop CC编辑得到的系统发育树图。
表1 本研究中分析的物种列表及其GenBank登录号
续表
2.1 线粒体基因组结构与特征
经NCBI BLAST 比对鉴定, 确定本研究所使用物种为狄氏斧蛤, 并将获得的狄氏斧蛤线粒体全基因组序列经注释后上传至NCBI数据库, GenBank序列号为MZ362260。狄氏斧蛤线粒体全基因组序列为
典型的环状结构(图1), 全长为16 908 bp, 碱基组成为A (26.81%)、T (41.13%)、G (21.21%)、C (10.85%); A+T含量为67.94%, 高于G+C的含量(32.06%), 表现出明显的AT偏向, 且AT偏斜值为–0.211, 而GC偏斜值为0.323。狄氏斧蛤线粒体全基因组序列共包含了13个蛋白编码基因, 22个tRNA基因和2个rRNA基因。
表2 狄氏斧蛤线粒体基因组成
图1 狄氏斧蛤线粒体基因组图谱
2.2 狄氏斧蛤线粒体基因组rRNA、tRNA分析
狄氏斧蛤线粒体基因组序列中的两个rRNA (和)分别由869个碱基和1 255个碱基组成, 其中位于tRNA和tRNA之间, 而则位于编码基因和之间(表2)。
22个tRNA的序列总长度为1 450 bp, 长度范围为63～69 bp, 长度最短的为tRNA,最长的为tRNA和tRNA。其中tRNA和tRNA基因各有两个, 而除tRNA基因缺失二氢尿嘧啶臂(DHU臂)外, 其余21个tRNA均含有典型的三叶草二级结构(图2)。此外, 在氨基酸臂中,tRNA和tRNA各自存在1对U-U不配对。在反密码子茎中, 由于A-C转换造成的tRNA中G-A不配对, 由于C-T转换造成的tRNA中A-C不配对。在TΨC 茎上,tRNA有两对U-U不配对。
2.3 狄氏斧蛤蛋白质编码基因分析
狄氏斧蛤线粒体基因组含有13个蛋白质编码基因(表3), A+T含量均高于50%, 可见其在蛋白编码基因组中也具有AT偏好性。13个蛋白质编码基因(I、、、、、、、II、、、、III、)都在H链上编码蛋白。编码基因拥有3种起始密码子(ATG、ATT、ATA), 其中I、、、、II、、III使用ATG作为起始密码子,、、、使用ATT作为起始密码子, 而以及则使用ATA作为起始密码子。在终止密码子的使用情况中, 狄氏斧蛤只有2种终止密码子, 除了、以及使用TAG作为终止密码子, 其余所有蛋白质编码基因都使用TAA作为终止密码子。
2.4 狄氏斧蛤同义密码子相对使用频率(RSCU)分析
密码子平均使用频率和相对同义密码子平均使用频率如表4和图3所示。狄氏斧蛤线粒体基因组13个蛋白质编码基因中存在32个偏好密码子(RSCU密码子), 密码子第三位点对A、T的偏好性与蛋白质编码基因密码子的第三位点对A、T偏向性相一致。密码子使用频率较高的为UUA (L)和GCU (A), 其次为GUU (V)、AUU (I)和AGU (S)等, 使用频率相对较低的为CGC (R)、CUC (L)和GUC (V)。在编码氨基酸的同义密码子中, 第3位点为A或者T的密码子使用频率较高。例如: 编码亮氨酸Leu (L)的同义密码子中, 密码子UUA (RSCU=2.4)使用频率远高于UUG (RSCU=1.16); 编码异亮氨酸Ile (I)的同义密码子中, 密码子AUU (RSCU=1.68)使用频率远高于密码子AUC (RSCU=0.32)。
图2 狄氏斧蛤线粒体tRNA二级结构
表3 狄氏斧蛤线粒体基因组碱基组成比较
图3 狄氏斧蛤线粒体基因氨基酸组成及同义密码子使用频率
注: a. 狄氏斧蛤线粒体基因氨基酸组成; b. 狄氏斧蛤线粒体基因同义密码子使用频率
表4 狄氏斧蛤13个编码蛋白编码基因密码子使用频率
注: *表示终止密码子; 括号内的字母表示各氨基酸名称的缩写; 表中加粗字体为氨基酸偏好密码子
2.5 樱蛤总科线粒体基因排序比较分析
对樱蛤总科贝类线粒体基因组的基因排序进行分析, 结果表明除紫云蛤科中的双线紫蛤()、卵紫蛤()、尖紫蛤()和中国紫蛤()没有基因外, 其余物种都拥有完整的13个蛋白质编码基因(图4); 五个科共有三种不同的排序方式, 其中斧蛤科、截蛏科、樱蛤科以及除紫云蛤科中的具有完全相同的基因排序。整个樱蛤总科中双带蛤科(Semelidae)的基因排序与其他科属区别最大, 双带蛤科在trnG-trnV-trnW-rrnS-cox2这一段基因排序中与其他科属不同点在于trnG、cox2和rrnS之间的易位, 其他物种在这段基因中的排序为cox2-trnV- trnW-trnG-rrnS, 除此之外其他物种之间的基因排序相似度都很高。狄氏斧蛤与本研究下载的所有同科物种都拥有相同的基因排列, 没有出现基因重排现象。
图4 樱蛤总科线粒体基因排序比较
2.6 系统发育树分析
基于最大似然法(ML)和贝叶斯推理(BI)两种方法作出的树型结构基本一致, 在大多数节点中都获得了较高的支持度(图5)。本研究涉及了Imparidentia超目下的5个目, 其中鸟蛤目(Cardiida)、贫齿蛤目(Adapedonta)以及满月蛤目(Lucinida)分别为单系群; 帘蛤目(Venerida)的单系性不被支持; 由于海螂目(Myida)仅有一个物种参与建树, 其单系性无法验证。此外, 帘蛤目为多系群, 且帘蛤目中的帘蛤总科与同心蛤总科聚集在同一枝系, 北极蛤总科、花蚬总科和蛤蜊总科聚集在同一枝系。其中帘蛤目下的同心蛤总科与海螂蛤科的砂海螂()聚集在同一分支, 分支支持度很高; 狄氏斧蛤所属的樱蛤总科为单系群, 樱蛤总科与贫齿蛤目的缝栖蛤总科和竹蛏总科聚集在同一分支, 但分支支持度不高; 狄氏斧蛤与斧蛤属的另外四个物种(、、、)聚为一支, 与紫云蛤科、截蛏科、樱蛤科和双带蛤科互为姊妹群。本次研究中, 基于线粒体基因组构建的系统发育树分支支持将鸟蛤目列为单独的一个目, 并且将狄氏斧蛤所属的樱蛤总科划归到鸟蛤目中。
图5 基于12个PCGs构建的狄氏斧蛤与其他双壳贝类系统发育树
通过研究狄氏斧蛤线粒体基因组碱基组成发现, 其基因组成呈现出明显的AT偏向性, 与大部分双壳贝类线粒体组成相似, 且在鱼类、鸟类、昆虫类等动物的线粒体基因中也都具有AT碱基偏好性特性(毛明光等, 2019; 赵婉清等, 2021; 雷莹等, 2021)。狄氏斧蛤线粒体基因组13个蛋白质编码基因都在H链上编码蛋白, 这与已报道的海水双壳贝类如小荚蛏(Feng, 2021)、等边浅蛤(夏立萍等, 2021)等在H链上编码蛋白一致, 而蒋文枰等(2010)指出造成这种情况的原因可能与它们生活在海水或淡水中有关, 但产生的机理还需要进一步研究。狄氏斧蛤含有完整的13个蛋白质编码基因, 其编码基因的种类和数目与多数双壳贝类类似, 而与仅含有12个蛋白质编码基因的真曲巴非蛤、文蛤以及短文蛤等不同(夏立萍等, 2021)。对于狄氏斧蛤的tRNA二级结构而言, 由于tRNA没有明显的DHU茎环导致tRNA已不能形成典型的三叶草结构, 这与在同一Imparidentia超目下的小荚蛏()的tRNA二级结构相似(Feng, 2021)。对于狄氏斧蛤密码子偏好性分析显示, 以NNU类型的密码子使用频率最高, 与其蛋白质编码基因组成中碱基T偏好性一致, 与文蛤属贝类结果类似(张志东等, 2019)。
线粒体基因组的重排可用于研究物种间的进化关系、系统发育的祖先谱系等, 双壳贝类的线粒体基因序列具有高度可变性, 是目前发现的后生动物中突变最多的物种(Serb, 2003)。研究樱蛤总科的基因排序关系时, 得出的结果显示只有紫云蛤科中的部分物种有基因的缺失, 根据之前的研究发现基因在软体动物中不是很保守,基因对自然选择的作用较为敏感, 因此具有较高的突变率(Mishmar, 2003); 整个樱蛤总科中, 只有双带蛤科基因排序与其他科属有部分不同, 这与远洋等(2012)研究的樱蛤总科与竹蛏总科的基因排序一致。同时, 基因排序的研究结果还可为后续系统发育分析提供相关信息。
从系统发育分析结果来看, 帘蛤目的单系性不被支持。构建的系统进化树分支将斧蛤科划归到樱蛤总科, 作为紫云蛤科、截蛏科、樱蛤科以及双带蛤科的姊妹群, 这与翁朝红等(2013)和Fernández-Pérez等(2017)测定的分类结果一致; 从总科的单系性来看, 樱蛤总科下的五个科聚集在同一枝系且分支支持度较高, 证实了樱蛤总科的单系性, 这与Taylor等(2007)的研究结果一致, 并且在以往的研究中也提到过, 樱蛤总科是单系群(Combosch, 2017)。到目前为止对于帘蛤目和鸟蛤目的分类还没有统一的标准, 在有的研究中依然将鸟蛤目划归为帘蛤目中的一个科(Fernández-Pérez, 2017), 这可能与构建进化树时使用到的基因不同有关, 因此得到的进化树分支不同。此外, 在之前的研究里有的学者还建议将樱蛤总科中的截蛏科划归到帘蛤目中(王琳楠等, 2013), 相关的具体分类地位还需要进一步研究。
本次研究利用生物信息学的方法, 在编码蛋白质水平进行了密码子偏好性分析, 明确了狄氏斧蛤的密码子偏好性及特征, 并基于线粒体基因组全序列构建了Imparidentia超目下部分贝类系统发育树, 分支支持将鸟蛤目列为单独的一个目, 并且将狄氏斧蛤所属的樱蛤总科划归到鸟蛤目中。研究结果可为斧蛤科贝类的物种鉴定和系统进化分析提供依据, 并可为狄氏斧蛤未来可持续发展及分子育种等工作提供理论基础。
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COMPLETE SEQUENCE AND GENE ORGANIZATION OF THE MITOCHONDRIAL GENOME OF CLAM
MA Yan-Wen, LI Ji-Ji, YE Ying-Ying
(National Engineering Research Center for Marine Aquaculture, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China)
To improve the systematics and taxonomy of, the complete mitochondrial genome ofwas sequenced and annotated by the Next-Generation Sequencing. Results show that the total length of the mitochondrial genome is 16 908 bp, consisting A (26.81%), T (41.13%), G (21.21%) and C (10.85%), and A+T content was 67.94%, showing obvious AT bias. Similar to other bivalves,contains 13 proteins, 22 tRNAs, and 2 rRNAsgenes, and all the genes are encoded by the H-strand. Protein-coding genes have three start codons (ATG, ATT, and ATA), and all protein-coding genes use TAA as the stop codon; except for,and, they use TAG as the stop codon. Among the 22 tRNA genes, 21 tRNA genes (except only fortRNA) can fold into a typical perfectsecondarystructure due to miss a distinct DHU stem ring. The gene arrangements of all species of the Donacidae are consistent. The phylogenetic tree of 62 species show thatandcluster into a small clade, andandcluster into a small clade, then clustered together withinto Donacidae. The phylogenetic tree supports theinclusion of the family Donacidae to the Tellinoidea, and the inclusion of the order Cardiida to which the Tellinoidea belongs as a separate order rather than as part of the order Venerida.Key words; mitochondrial genome; gene rearrangement; phylogenetic analysis
S917
10.11693/hyhz20220400101
*浙江省省属高校基本科研业务费, 2021J005号; 舟山市科技计划项目, 2021C21017号。马颜雯, 硕士研究生, E-mail: toby0703@163.com
叶莹莹, 硕士生导师, E-mail: yeyy@zjou.edu.cn
2022-04-19,
2022-07-07
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