中性粒细胞胞外诱捕网在肺部疾病中作用的研究进展

丁 雨，吴 艳，卞 涛

南京医科大学附属无锡人民医院 呼吸与危重症科，江苏 无锡 214023

中性粒细胞是对抗入侵病原体的第一道防线，同时也是参与适应性免疫应答、急性损伤修复、肿瘤等发生发展的免疫细胞。中性粒细胞受刺激后，可通过吞噬、脱颗粒等方式发挥作用；
近年来发现中性粒细胞是以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酶依赖为主要方式释放装饰有抗菌颗粒蛋白的解凝染色质而发挥作用的，并将其称为中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)，这一过程被称为“NETosis”。最初发现NETs时，认为其主要发挥中性粒细胞的传统功能，即杀灭病原体和对抗感染，但越来越多的研究表明大量中性粒细胞的NETs反应与许多疾病的不良预后有关，特别是新型冠状病毒肺炎/感染(corona virus disease 2019,COVID-19)、细菌性肺炎、慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘和肺部转移性肿瘤等肺部疾病。

1.1 中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)的形成

NETs首次于2004年被发现并描述，病原体侵入肺部时，活化的中性粒细胞发挥抗感染的作用，除吞噬、脱颗粒外，同时也释放出NETs[1]。至今为止，除病原体外，佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macro-phage colony-stimulating factor，GM-CSF)、一氧化氮、自身免疫相关抗体以及血小板等均可刺激中性粒细胞发生NETosis。刺激因素不同，NETs成分有差异，但NETs始终包含一组固定的蛋白质，如中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、瓜氨酸组蛋白 3 (citrul-line histone 3，CITH3)、钙保护素、α-防御素、抗菌肽和细胞骨架蛋白质等[2]。

中性粒细胞受到刺激后，细胞膜上受体如G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptors,GPCRs)，趋化因子和细胞因子受体、Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)和Fc受体将信号传入细胞内，氧化产物的上游分子Raf-MEK-ERK通路启动，随后的下游信号NADPH氧化酶复合物激活。NETs的形成依赖于细胞骨架重排、糖酵解产生的ATP与线粒体功能障碍和NADPH氧化酶复合物激活状态下产生的高浓度活性氧(reactive oxygen species，ROS)[3]。ROS产生后，NE从膜相关复合物解离到细胞质中，并以依赖MPO的方式激活其蛋白水解活性,随后，NE转位进入细胞核，NE和MPO驱动染色质解凝和组蛋白切割，这可以由依赖肽酰基精氨酸脱亚胺酶4(peptidylarginine deiminase 4，PAD4)的组蛋白瓜氨酸化支持,此外，也有NE和PAD4各自独立参与的途径被描述[4]。抑制白细胞信号抑制受体-1可以在不影响氧化产物的情况下阻止NETs的产生,最终的细胞裂解和NETs释放涉及GasderminD，它能够在颗粒和质膜上形成孔，染色质和抗菌蛋白组成的混合物以囊泡的形式从中性粒细胞释放到胞外，形成NETs，这种NETs的形成最终导致细胞死亡，通常被描述为溶解性NET释放或NETosis,此过程一般需要3～8 h,是NETs形成的主要方式[5]。

1.2 中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)的降解

NETs可以被脱氧核糖核酸酶(DNase)降解，生理量的DNase不足以在体外完全降解NETs，树突状细胞和巨噬细胞在NETs的降解中发挥着重要作用，巨噬细胞以依赖抗菌肽LL-37复合物的方式吞噬NETs，巨噬细胞对NETs的降解依赖于TREX1(也称为DNaseⅢ)、DNase1和DNase1L3，其中，DNase1L3由树突状细胞产生,DNase1L3与DNaseI一起成为重要的细胞外NETs降解核酸酶，TREX1参与巨噬细胞吞噬NETs后的细胞内降解[6]。关于NETs这些细胞外结构的具体清除机制，目前所知甚少。因此，探索NETs清除和降解的机制可能有助于理解炎性反应和自身免疫性疾病，并为未来的治疗提供新思路。

2.1 抑制NETs可有效控制病毒感染

在感染性肺部疾病中，NETs的产生增强和清除不足是导致组织损伤的关键驱动因素，当前的COVID-19大流行背景突出了探索NETs的重要性。COVID-19危重患者血清诱导NETs释放[7]，NETs与炎性反应严重程度和免疫介导的微血栓相关，并且可预测不良预后[8]。

首先，在病毒入侵和轻微症状的初始阶段，NETs的主要成分NE从细胞表面切割S蛋白进入细胞，增强病毒的感染性[9]。同时中性粒细胞产生过量的ROS，加重免疫反应。ROS进一步促进NETs的产生，NETs捕获病毒并阻止其传播。在涉及凝血异常和呼吸道症状的第二阶段，NETs的细胞外阳离子组蛋白，发挥细胞毒活性，促进IL-1β的生成，并通过激活TLR2、TLR4和TLR9介导促炎作用[10]。NETs能增强各种细胞因子的产生，包括IL-1β和TNF-α，以增强炎性反应。此外，IL-1β和TNF-α作为主要激活因子，诱导IL-6水平升高[11]。NETs成分也可以通过炎性小体激活物和损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)介导补体激活促进炎性反应,导致细胞凋亡和纤维化,近期发现，SARS-CoV-2可通过血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)和丝氨酸蛋白酶活性轴刺激中性粒细胞释放NETs, NETs直接诱导肺上皮细胞死亡[12]。在全身血栓形成和炎性反应的第三阶段，随着炎性反应进一步增强，更多的中性粒细胞被招募，巨噬细胞清除NETs的能力受损，二者共同导致了高水平的NETs。NETs的抗菌肽LL-37和MPO引起免疫细胞趋化并使巨噬细胞极化成M1型巨噬细胞，巨噬细胞分泌促炎物质加重炎性反应和肺损伤[13]。此外，NETs通过TLR4/TLR9/NF-κB信号通路触发巨噬细胞中NLRP3炎性小体激活和IL-1β释放,随后，大量的细胞因子又反过来促进了NETs的产生[14]。表明作用于巨噬细胞的NETs与促炎细胞因子的增加有关，而促炎细胞因子导致了NETs形成的失调，进一步形成细胞因子风暴，维持异常的全身炎性反应。

事实上，抑制中性粒细胞和NETs在各种流感病毒相关急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)中具有保护作用，其他大流行性病毒，包括H1N1流感、SARS冠状病毒和中东呼吸综合征冠状病毒，都与感染部位的中性粒细胞浸润和ARDS的发展有关。因此，抑制NETs是治疗包括COVID-19在内的病毒性感染的一个潜在治疗靶点。

2.2 细菌降解NETs实现免疫逃逸

NETs在几种与细菌相关的肺部疾病中发挥抗感染的作用，一些细菌已经进化出了避免被NETs捕获和杀死的策略。例如：铜绿假单胞菌是临床上导致院内感染的重要条件[15]，严重的铜绿假单胞菌感染在免疫功能低下的个体中普遍存在，包括中性粒细胞减少、严重烧伤、囊性纤维化和慢性阻塞性肺疾病患者，此外，铜绿假单胞菌导致的机械通气相关肺炎在危重患者导致高发病率和病死率。铜绿假单胞菌分泌大量的胞外蛋白酶，使其能够逃脱宿主的免疫攻击，如弹性蛋白酶和碱性蛋白酶(AprA)。AprA是一种由Ⅰ型分泌系统分泌的金属蛋白酶。首先，AprA降解NETs组分，帮助介导铜绿假单胞菌的免疫逃逸。其次，AprA诱导产生抗体，抗体作为激动剂，又增强AprA的活性，进一步帮助逃脱，但铜绿假单胞菌逃脱NETs杀伤的更加确切的机制尚不明确[16]。因此，针对其他铜绿假单胞菌产生的酶抗体是否也有类似的效应，还有待进一步研究。

3.1 慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)

COPD发病率、病死率和所致的经济负担是全球共同关注的重大问题,中性粒细胞被认为是COPD患者气道炎性反应的关键介质。尤其是Ig样凝集素F (SiglecF)中性粒细胞在加重气道炎性反应中发挥重要作用。空气污染物通过细胞外三磷酸腺苷传递DAMP信号诱导中性粒细胞上SiglecF的表达，中性粒细胞释放NETs和产生半胱氨酰白三烯来促进2型和3型免疫应答，加重COPD气道炎性反应[17]。

目前，使用支气管扩张剂和糖皮质激素是治疗COPD主要的治疗方法。在慢性炎性反应的整个过程中，COPD患者的严重程度与气道内NETs水平呈正相关，因此，新型NETs靶向疗法可能是治疗COPD的一种富有前景的方法，但直接靶向NETs是否能抑制COPD患者的病情发展，目前尚不清楚。

3.2 支气管哮喘

支气管哮喘是一种慢性气道炎性反应起关键作用的异质性疾病,当各种过敏原刺激机体时，循环中的中性粒细胞在IL-6、IL-8等细胞因子的诱导下聚集到气道浸润并激活[18]。LPS诱导形成的NETs可以直接或间接地损伤了肺上皮紧密连接蛋白occludin，加剧中性粒细胞为主导的过敏性气道炎性反应的严重程度，由此推断NETs可能是通过破坏肺上皮的紧密连接参与严重哮喘发病机制[19]。NETs也刺激巨噬细胞分泌IL-1β，促进中性粒细胞在气道的浸润，浸润的中性粒细胞产生NETs，可放大NETs和巨噬细胞造成的组织损伤，诱导和加重中性粒细胞型哮喘(neutrophil-dominated asthma，NA)，即NETs通过巨噬细胞促进NA发病[20]。此外，嗜酸细胞胞外陷阱(eosinophil extracellular traps，EETs)与嗜酸粒细胞型哮喘严重程度有关，EETs通过整合免疫和神经信号以推动哮喘进展[21]。

在治疗方面，研究发现哮喘以循环中CITH3增加为特征，这可能与细胞胞外陷阱(ETs)形成有关。抑制ETs可能是特定哮喘表型(如中性粒细胞哮喘)的治疗选择，这也为治疗哮喘提供了新的思路。

在小鼠和人类中，中性粒细胞是主要的白细胞群体，中性粒细胞在肿瘤生长和转移过程中发挥着重要作用。晚期肺癌和结肠癌患者体内循环NETs水平升高，利用小鼠肺癌和结肠癌模型，发现阻断NETosis显著抑制肺和肝脏的自发转移。此外，乳腺癌细胞分泌的组织蛋白酶C(tumor-secreted protease cathepsin C，CTSC)通过调节中性粒细胞的募集和NETs的形成促进了乳腺到肺的转移。同时揭示了一个有趣的新途径，CTSC激活中性粒细胞膜结合蛋白酶3(PR3)，从而促进IL-1β加工和NF-κB活化，最终上调IL-6和CCL3促进中性粒细胞募集。CTSC-PR3-IL-1β轴诱导ROS的产生和NETs的形成，这可促进肿瘤细胞在肺部的转移，抑制CTSC可以抑制实验性肺转移[22]。但目前尚不清楚靶向CTSC-PR3-IL-1β-NET通路的疗效是否仅限于防止肺转移，还是也可以防止其他组织的转移,该研究为今后的临床相关研究指明了方向。

除了发现NETs在癌转移中发挥作用外，肺癌细胞释放损伤相关分子模式高迁移率族蛋白B1(HMGB1)，HMGB1也促进了NETs的形成[23]。肺癌中细胞外RNA和NETs存在交互作用，非小细胞肺癌细胞比正常肺泡细胞有更高水平的和NETs相关的lncRNA,经NETs刺激后，lncRNA表达明显增加,共12种NETs相关的lncRNA可以作为预测非小细胞肺癌患者生存的分子标志物[24]。

综上所述，表明NETs靶向治疗可能限制转移和原发性肺癌，这些已在小鼠模型中得到证实。但同时，人类中性粒细胞和小鼠中性粒细胞释放NETs的能力明显不同，在研究肿瘤NETosis(中性粒细胞的炎性细胞死亡方式)时应考虑物种间差异，并且目前为止还没有临床试验来评估靶向NETs对癌进展的影响。这些开创性的发现还需开展临床试验，以确定NETs靶向疗法是否可以减少转移。

自发现NETs，关于NETs的形成和作用机制在肺部疾病中的研究越来越多，新型冠状病毒疫情的暴发更进一步推动了该方面的研究。NETs发挥着双刃剑作用：NETs在疾病的早期阶段发挥抗感染作用，然而，在疾病的晚期阶段，NETs的抗菌成分不再能够对抗感染，而是造成自身组织损伤，因此，维持NETs平衡成为治疗肺部疾病的关键，促进研发更多潜在药物，如选择性NETs形成抑制剂或NETs相关蛋白抑制剂等，可以防止NETs对患者的有害影响，这可能将成为新兴的治疗手段。此外，目前的体外研究，多数是以非生理因素如PMA触发的实验结果，很可能不能代表体内的情况，并且在同一疾病的不同阶段，对NETs的研究很少，因此，进行更多的关于NETs对不同时期肺部疾病的研究也有助于加强对肺部疾病发病机制的理解，指导未来治疗的发展。

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