查 萌, 田志强, 李建成, 路子云, 李 贞, 张松斗, 刘小侠*
(1.中国农业大学植物保护学院, 北京 100193; 2.河北省农林科学院植物保护研究所, 保定 071000)
棉铃虫Helicoverpaarmigera(Hübner)作为多食性害虫,严重为害棉花、小麦和玉米等多种粮食和经济作物,给农业生产造成了巨大的损失[1]。传统化学药剂防治带来了环境污染、害虫抗药性等一系列问题[2]。生物防治是棉铃虫绿色防控的重要手段之一[3-4]。中红侧沟茧蜂Microplitismediator(Halidag)是一种独居性内寄生蜂,可寄生棉铃虫低龄幼虫,通过抑制幼虫取食而使其失去为害能力,是田间害虫生物防控的重要因子[5-8]。棉铃虫核型多角体病毒(Helicoverpaarmigeranucleopolyhedrovirus, HearNPV)作为一种重要的害虫病原微生物,由于其安全、高效,且对非靶标生物低毒等特点而被广泛应用于农业和林业害虫防治[9-11]。
寄生性天敌与微生物源农药协同应用,在害虫综合治理中仍然面临着较多挑战。有研究表明,寄生蜂携带并传播病毒对病毒在宿主种群中的流行以及对害虫种群的控制起到重要作用。例如茧蜂科寄生蜂Microplitiscroceipes(Cresson)可以传播3种野生型昆虫病毒,有效提高烟芽夜蛾Heliothisvirescens(Fabricius)的感毒率[12];黑腿绒茧蜂Apantelesmelanoscelus(Ratzeburg)先在感毒寄主体内产卵再寄生健康寄主时,能够将舞毒蛾核型多角体病毒(Lymantriadisparnecleopolyhydrovirus, LdNPV)传播至健康宿主种群;黑唇姬蜂Campoletissonorensis(Cameron)通过产卵器传播烟芽夜蛾核型多角体病毒的效率高达40%[13];菜粉蝶绒茧蜂Apantelesglomeratus(Linnaeus)传播菜粉蝶颗粒体病毒(Pierisrapaegranulovirus, PrGV)的效率能达到81%～95%[14]。此外,对于一些不能经口感染的病毒,如囊泡病毒(Ascovirus, AV),只能依赖于寄生蜂的产卵行为将病毒注射到宿主血淋巴来进行侵染[15-16]。
寄生蜂的传毒方式对传毒效率有重要影响,例如寄生蜂在感染病毒的寄主体内产卵使产卵器携带病毒,随后通过产卵将病毒传播至健康宿主体内,从而实现病毒的水平传播[17]。同时寄生蜂通过爬行等活动将体表携带的病毒沾染到寄主昆虫的生境内,也能够使病毒在宿主种群中水平传播[18]。此外,给寄生蜂饲喂含有病毒的蜂蜜水或用病毒悬浮液浸泡蜂茧也能传播一定量的病毒,但具体的传毒机制尚不明确[19-20]。
中红侧沟茧蜂与棉铃虫核型多角体病毒均能够对棉铃虫的种群数量起到较好的控制作用。但当二者同时使用时,中红侧沟茧蜂能否充当病毒的传播载体,在棉铃虫种群内部传播病毒尚未见相关研究报道。探究不同方式下中红侧沟茧蜂对HearNPV的传毒效率以及具体的传播机制,将会为协同利用寄生蜂和昆虫病毒防治棉铃虫提供一定的参考和借鉴。
1.1 供试材料
棉铃虫:来自中国农业大学有害生物综合治理实验室。幼虫、蛹、成虫均饲养在人工光照培养箱中,光周期L∥D=14 h∥10 h, 温度(26±1)℃,相对湿度(70±10)%。幼虫用人工饲料饲喂[21]。羽化为成虫后每天用10%蜂蜜水饲喂,雌成虫产卵后使用0.5% 84消毒液对卵布进行消毒处理,随后使用清水冲洗干净。
中红侧沟茧蜂:由河北省农林科学院植物保护研究所提供。将200头中红侧沟茧蜂的蜂茧置于指形管中羽化,羽化后的成虫放入树脂蜂箱(80 cm×80 cm×80 cm)中饲养并进行交配,将蜂箱放在人工气候培养箱里,培养条件为:光周期L∥D=14 h∥10 h, 温度(26±1)℃,相对湿度(70±10)%。每天提供10%蜂蜜水作为成虫营养源。成蜂羽化并自由交配2～3 d后进行寄生繁育子代。
病毒:棉铃虫核型多角体病毒(Helicoverpaarmigeranucleocapsid nucleopolyhedrovirus,HearNPV)干粉,每克含包涵体数量为5×1011个(5×1011OBs/g),购买于河南济源白云实业有限公司。
1.2 中红侧沟茧蜂不同带毒方式的传毒效率测定
1.2.1体表喷洒病毒的寄生蜂传毒试验
选取羽化后2～3 d的中红侧沟茧蜂雌蜂(羽化后2～3 d是中红侧沟茧蜂的交尾高峰期),用小喷瓶均匀喷洒2.5×107OBs/mL HearNPV悬浮液至寄生蜂体表,每头蜂单头处理,喷洒3泵的量。自然晾干10 min后让其寄生健康棉铃虫,具体方法为:将蜂引入放有单头3龄初棉铃虫的培养皿(d=10 cm),观察到寄生蜂有产卵行为后将棉铃虫取出单头饲养,继续放入下一头棉铃虫,每只寄生蜂寄生5头健康棉铃虫,连续寄生3 d,观察50头带毒寄生蜂在带毒第1天(处理当天)、第2天、第3天的寄生行为,分别统计棉铃虫的染毒率。棉铃虫虫体发白、行动迟缓、最终液化死亡为典型的染毒死亡症状,据此可判定棉铃虫死亡由病毒引起。染毒率=染毒棉铃虫/处理的棉铃虫总数×100%。
1.2.2在染毒棉铃虫体内产卵的寄生蜂传毒试验
让棉铃虫2龄初幼虫取食滴加有2.5×107OBs/mL HearNPV悬浮液的小块饲料,取食24 h后更换紫外照射30 min的新鲜人工饲料,取食带毒饲料3 d后让充分交配的中红侧沟茧蜂雌蜂寄生染毒的棉铃虫幼虫,方法为:将10头染毒的棉铃虫放入培养皿(d=10 cm),再引入1头雌蜂,观察到寄生蜂产卵1次后立即取出,继续引入下一头雌蜂。共引入50头雌蜂作为染毒蜂用于后续试验。让寄生过染毒棉铃虫的寄生蜂连续3 d寄生健康的3龄初棉铃虫幼虫。寄生方法同1.2.1。统计棉铃虫的染毒率。
1.2.3饲喂含毒蜂蜜水的寄生蜂传毒试验
用10%的蜂蜜水配制HearNPV悬浮液,浓度为2.5×107OBs/mL,让充分交配3 d的中红侧沟茧蜂雌蜂取食1 d后寄生健康的3龄初棉铃虫幼虫。寄生方法同1.2.1,连续寄生3 d,统计棉铃虫的染毒率。
1.2.4蜂茧浸毒的寄生蜂传毒试验
取1日龄的中红侧沟茧蜂蜂茧,于2.5×107OBs/mL HearNPV悬浮液中浸泡10 s,自然晾干后单个茧放入指形管中,置于人工气候箱[光周期L∥D=14 h∥10 h, 温度(26±1)℃,相对湿度(70±10)%]中羽化,羽化后蜂放到一起充分交配3 d,然后让雌蜂寄生健康3龄初棉铃虫。寄生方法同1.2.1,连续寄生3 d,统计棉铃虫染毒率。
1.2.5从染毒棉铃虫体内发育而来的寄生蜂传毒试验
让羽化后充分交配的中红侧沟茧蜂雌蜂寄生棉铃虫2龄末幼虫。方法为:将1头雌蜂引入放有10头健康2龄初棉铃虫幼虫的培养皿(d=10 cm)中,共寄生100头棉铃虫,寄生2 d后给棉铃虫饲喂滴加有10 μL 104OBs/mL的HearNPV悬浮液的小块人工饲料,收集棉铃虫体内发育而来的寄生蜂蜂茧,单个置于指形管中羽化,羽化后充分交配3 d,再让其寄生健康的3龄初棉铃虫幼虫。寄生方法同1.2.1,连续寄生3 d,统计棉铃虫的染毒率。
对照组(CK)采用不进行任何病毒处理的中红侧沟茧蜂雌蜂,羽化后充分交配3 d再进行试验。处理组和对照组的寄生蜂每头寄生5头健康的棉铃虫幼虫。采用单头观察法,将寄生蜂和单头未染毒的棉铃虫幼虫同时放入培养皿(d=10 cm)中,观察到寄生蜂产卵后立即将棉铃虫幼虫取出,单头放入指形管中加入新鲜人工饲料饲养,供试的健康棉铃虫幼虫为体型基本一致的3龄初幼虫,每种带毒方式测试50头中红侧沟茧蜂雌蜂。处理组和对照组的50头雌蜂寄生的棉铃虫主要表现为染毒、被寄生、未被寄生(正常状态)、不明原因(非染毒和寄生的症状),统计每种情况的比例。
1.3 不同带毒方式下寄生蜂体内病毒量检测
1.3.1构建HearNPV拷贝数与Ct值的标准曲线制作
给2龄棉铃虫饲喂滴加10 μL 2.5×107OBs/mL HearNPV悬浮液的小块饲料,待棉铃虫发育至3龄时提取DNA。以提取的DNA样品为模板,用HearNPV的polyhedrin基因引物(序列:F:5′-CAAACCGAACCGTTGTTACC-3′,R:5′-TGCAA-GTTCATAACGGGAC-3′)进行PCR扩增[21],polyhedrin基因片段连接到载体pMD18-T上,再转化至大肠杆菌Escherichiacoli感受态细胞DH5α中,挑取单克隆提取质粒,以10倍梯度稀释为1.21×104～1.21×109拷贝/μL的质粒作为模板,以polyhedrin基因的引物进行实时荧光定量RT-PCR,每浓度设3个重复,生成Ct值与拷贝数之间的标准曲线,根据标准曲线可以求出待测样品的拷贝数。
1.3.2不同传毒方式下中红侧沟茧蜂携带的病毒量检测
取1.2中不同带毒方式处理的中红侧沟茧蜂雌蜂,提取单头蜂的DNA,以提取的DNA为模板,用病毒polyhedrin基因引物进行荧光定量PCR,根据标准曲线计算寄生蜂携带的病毒含量[20]。每组处理分别检测10头。
1.3.3饲喂含毒蜂蜜水的中红侧沟茧蜂雌蜂卵巢病毒检测
由1.2中不同带毒方式下的中红侧沟茧蜂传毒效率结果得出,饲喂含毒蜂蜜水的方式寄生蜂的传毒效率较高,为了进一步探究寄生蜂是否经消化系统、生殖系统进行传毒,解剖了饲喂含毒蜂蜜水1 d后的寄生蜂的卵巢,并提取DNA检测病毒量,对照组为未接触病毒的中红侧沟茧蜂雌蜂卵巢。病毒阳性对照为2.5×107OBs/mL HearNPV悬浮液。
1.4 数据统计
利用SPSS 25.0软件对试验数据进行统计分析,应用Duncan氏多重比较法对不同传毒方式处理下寄生蜂携带的病毒含量、卵巢病毒含量进行差异显著性检验。
2.1 中红侧沟茧蜂不同带毒方式的传毒效率
如图1所示,中红侧沟茧蜂体表带毒(图1a)和饲喂含毒蜂蜜水(图1b)的方式下,处理组和对照组80%左右的棉铃虫表现为被寄生的症状,在寄生蜂连续传毒的3 d内,处理组均有棉铃虫染毒死亡,且随着寄生蜂携毒时间的延长,染毒率呈下降趋势。在染毒寄主体内产卵、蜂茧浸毒、繁育寄主带毒方式下,除了蜂茧浸毒在传毒第1 天和繁育寄主带毒后传毒第1 天棉铃虫染毒率分别为1.2%、5.7%以外,其余传毒时间棉铃虫的染毒率均为0(图2)。表明在上述3种情况下中红侧沟茧蜂不能传播病毒。
图1 寄生蜂体表带毒(a)、饲喂含毒蜂蜜水(b)传毒方式下棉铃虫症状的比例
图2 在染毒寄主体内产卵、蜂茧浸毒、繁育寄主带毒方式下棉铃虫症状的比例
统计分析显示(表1),中红侧沟茧蜂体表喷洒病毒以及饲喂含毒的蜂蜜水2种带毒方式下的传毒效率相对较高,在传毒的第1、2、3天分别为15.1%、9.1%～9.3%、2.4%～4%,随着传毒时间的延长,传毒效率逐渐降低。其他方式下的传毒效率几乎为0。
表1 不同带毒方式下中红侧沟茧蜂寄生后棉铃虫的染毒率
2.2 不同带毒方式下寄生蜂携带的病毒量检测
由Ct值与HearNPV拷贝数得出Ct值与HearNPV拷贝数对数的线性关系为y=-3.4254x+ 39.786(x表示Ct值,y表示HearNPV拷贝数的对数),图中(图3)数据显示,处理组中红侧沟茧蜂雌蜂的病毒拷贝数显著高于对照组(F=9.271,df=5,P<0.05)。其中寄生蜂体表喷洒病毒的处理方式携带病毒量最多[lg(HearNPV拷贝数)≥3],在染毒棉铃虫体内产卵的寄生蜂携带病毒量相对较少[lg(HearNPV拷贝数)为2.3]。为探究饲喂含毒蜂蜜水时中红侧沟茧蜂是否通过生殖系统进行传播,检测了饲喂含毒蜂蜜水的中红侧沟茧蜂卵巢中的病毒含量,得出病毒拷贝数的对数为0.27(图4),对照组病毒拷贝数的对数为0.34,同对照组无显著差异,说明取食含毒蜂蜜水后,卵巢中基本不含有病毒。
图3 不同带毒方式下的寄生蜂病毒含量
图4 饲喂含毒蜂蜜水的中红侧沟茧蜂卵巢病毒含量
本试验结果表明,几种不同的带毒方式下,中红侧沟茧蜂对HearNPV的传播效率均较低,为0～15%。其中,饲喂含有病毒的蜂蜜水、蜂体表喷洒病毒悬浮液的传毒效率相对较高,在传毒的第1天达到15.1%。而蜂茧带毒、繁育寄主带毒和在染毒寄主体内产卵的方式几乎不能传播病毒,传毒效率第1天不超过6%,后2 d传毒效率为0。
本研究得出寄生蜂通过不同的处理方式能够携带部分病毒,但带毒量与传毒效率并非成正相关,例如雌蜂从感染病毒寄主体内发育而来、蜂茧浸毒的携毒量与饲喂含毒蜂蜜水的携毒量相当,但是传毒效率却相差较大,原因可能是:从感毒棉铃虫体内发育而来的雌蜂以及蜂茧浸毒的雌蜂虽然携带一定量病毒,但其携带的病毒无法直接传播至棉铃虫体内或周围的环境,导致传毒效率低,饲喂含毒蜂蜜水是将雌蜂直接暴露于含有病毒蜂蜜水的棉球,蜂体表易沾染上病毒,在寄生时可以将病毒传播至寄主的体表或周围的环境和食物中,更容易经口摄入,增加了染毒的概率。
通常情况下,寄生蜂在田间传播病毒有两种方式,一种是通过产卵行为将病毒注射到寄主血淋巴内;另一种是寄生蜂体表携带病毒,在寄主搜寻和寄生过程中将病毒带到宿主生存的环境或宿主体表使宿主染毒[23-24]。本研究发现体表喷洒病毒和饲喂含毒蜂蜜水的传毒效率较高,且在连续传毒的3 d内,这2种方式的传毒效率几乎相等,并无显著差异。饲喂含毒蜂蜜水的雌蜂卵巢中的病毒量与对照无显著差异,说明病毒不是经过寄生蜂的生殖系统进行传播。给中红侧沟茧蜂饲喂含有病毒的蜂蜜水、蜂体表喷洒病毒悬浮液表现较高的传毒效率,说明很可能是通过体表沾染病毒来传播,寄生蜂在取食含毒蜂蜜水的过程中体表沾染了病毒,在寄生过程中将体表的病毒带到棉铃虫体表或生境中,进而实现病毒的传播。Stoianova等将病毒悬浮液喷洒在寄生蜂体表,病毒的传播率明显高于在染毒寄主体内产卵而带毒的方式,主要原因为体表沾染病毒后,寄生蜂既可以通过产卵将病毒引入寄主体内,也可以将病毒传播至寄主昆虫的食物上使其取食染毒,增加了病毒进入寄主体内的途径,因此传毒率相对较高[25]。Young等也认为通过体表带毒将病毒引入寄主体内的概率要高于在染毒寄主体内产卵的传毒方式[18]。
在不同的寄生蜂-病毒-寄主系统中,寄生蜂能否传播病毒以及具体的传毒效率均有差异[19]。Zhang等测试了淡足侧沟茧蜂Microplitispallidipes(Szepligeti)4种不同的带毒方式——在染毒主体内产卵、繁育寄主带毒、蜂体表带毒、给寄生蜂饲喂含毒蜂蜜水下对甜菜夜蛾核型多角体病毒(Spodopteraexiguamultiple necleopolyhydrovirus, SeMNPV)的传播效率,结果表明不同带毒方式传毒效率相差较大,体表带毒方式下传毒效率显著高于其他几种方式[20]。影响病毒传播效率的因素还包括供毒寄主本身携带的病毒载量。有研究结果表明寄生蜂只有在寄主染毒症状表现十分明显时才能将其体内的病毒传播到健康的寄主,且传毒效率随着供毒寄主感染病毒浓度的升高而增加[26-28]。本研究只是初步统计了单一病毒浓度下的中红侧沟茧蜂传毒效率,且采用的供毒寄主是染毒2 d的棉铃虫,可能棉铃虫体内病毒量不高导致寄生蜂产卵器上未携带足量病毒,限制了传毒效率。因此,还可以进一步探究以饲喂不同浓度病毒或染毒不同天数的棉铃虫作为供毒寄主时中红侧沟茧蜂的传毒效率。
本研究明确了给中红侧沟茧蜂饲喂含毒蜂蜜水和体表喷洒病毒方式下传毒效率相对较高,中红侧沟茧蜂在染毒宿主体内产卵、从染毒宿主体内发育、蜂茧浸泡病毒3种方式几乎不能传播病毒。总体来说,中红侧沟茧蜂对HearNPV的传播效率有限,后续可以探索开发新的寄生蜂传播病毒的策略。
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